Une carte du paysage biochimique de la Rubisco
Étude de la cartographie fonctionnelle de l’enzyme Rubisco
Contexte
La Rubisco (ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygénase) est l’enzyme la plus abondante sur Terre, responsable de la fixation du dioxyde de carbone (CO₂) lors de la photosynthèse. Cependant, l’efficacité catalytique de la Rubisco est faible, et elle est sujette à des réactions secondaires avec l’oxygène, ce qui limite l’efficacité de la photosynthèse. Bien que les scientifiques aient longtemps tenté d’améliorer les performances catalytiques de la Rubisco par des approches d’ingénierie, les progrès ont été lents en raison de la difficulté à mesurer efficacement ses paramètres biochimiques complexes, tels que la vitesse catalytique, l’affinité pour le CO₂ et la spécificité. Récemment, avec le développement des techniques de criblage à haut débit et des méthodes d’apprentissage automatique, les scientifiques ont commencé à explorer systématiquement les relations séquence-fonction de la Rubisco, dans l’espoir de trouver des voies potentielles pour améliorer ses performances.
Cette étude, menée par une équipe de scientifiques de l’Université de Californie à Berkeley, du Howard Hughes Medical Institute, de la Nanyang Technological University et d’autres institutions, a été publiée en 2024 dans la revue Nature. L’équipe a développé une méthode de criblage à haut débit basée sur une souche d’Escherichia coli modifiée, cartographiant systématiquement le paysage séquence-fonction de la Rubisco et révélant la diversité de ses fonctions biochimiques ainsi que des possibilités d’ingénierie.
Méthodologie et processus de recherche
1. Construction de l’objet d’étude : Souche d’E. coli dépendante de la Rubisco
L’équipe a d’abord construit une souche d’E. coli dépendante de l’activité enzymatique de la Rubisco, appelée Δrpi. Cette souche, obtenue par délétion du gène rpi (codant pour la ribose-5-phosphate isomérase), ne peut croître en utilisant le glycérol comme seule source de carbone, sauf si elle exprime une Rubisco fonctionnelle. La Rubisco convertit le ribulose-1,5-bisphosphate (RuBP) en 3-phosphoglycérate, réintégrant ainsi le métabolisme central du carbone et permettant la croissance de la souche. Cette conception lie directement l’activité enzymatique de la Rubisco au taux de croissance de la souche, fournissant une base pour le criblage à haut débit.
2. Construction et criblage de la bibliothèque de mutants
L’équipe a choisi la Rubisco de type II de Rhodospirillum rubrum comme enzyme modèle et a construit une bibliothèque de mutants contenant 8 760 mutants à un seul acide aminé. Les étapes spécifiques sont les suivantes : - Conception de la bibliothèque de mutants : Le gène de la Rubisco a été divisé en 11 fragments, et tous les mutants possibles à un seul acide aminé ont été conçus et synthétisés pour chaque fragment. - Construction de la bibliothèque de mutants : Les fragments mutants ont été insérés dans un vecteur par assemblage Golden Gate, et des codes-barres aléatoires ont été introduits pour l’analyse de séquençage ultérieure. - Criblage à haut débit : La bibliothèque de mutants a été transformée dans la souche Δrpi et criblée dans des conditions de croissance à différentes concentrations de CO₂. L’abondance des codes-barres avant et après le criblage a été analysée par séquençage à lecture courte (Illumina), et le taux de croissance relatif (ou “fitness”) de chaque mutant a été calculé.
3. Inférence des paramètres cinétiques enzymatiques
Pour analyser plus en détail les propriétés biochimiques des mutants de la Rubisco, l’équipe a modifié la concentration de CO₂ dans l’environnement de culture et a ajusté un modèle cinétique de Michaelis-Menten pour déduire la vitesse maximale (Vmax) et la constante de demi-saturation pour le CO₂ (Kc) de chaque mutant. Les méthodes spécifiques sont les suivantes : - Expérience de titration au CO₂ : La bibliothèque de mutants a été cultivée à différentes concentrations de CO₂, et le fitness de chaque mutant a été mesuré. - Ajustement des paramètres cinétiques : Les données de fitness ont été ajustées à l’équation de Michaelis-Menten pour calculer la Vmax et la Kc de chaque mutant. - Validation expérimentale : L’activité enzymatique in vitro de certains mutants a été mesurée pour valider la Kc et la Vmax, confirmant la fiabilité des résultats du criblage.
4. Analyse des données et relations structure-fonction
L’équipe a exploré les relations entre les changements fonctionnels des mutants de la Rubisco et leur structure grâce à des alignements de séquences multiples et à des analyses structurales. Les données ont été analysées sous plusieurs angles : - Tolérance aux mutations : La tolérance aux mutations de chaque position d’acide aminé a été évaluée, révélant que certains sites hautement conservés sont très tolérants aux mutations. - Mutations améliorant la fonction : Quelques mutations capables d’améliorer significativement l’affinité pour le CO₂ ont été identifiées, comme V266T et A102Y. - Relations structure-fonction : L’analyse structurale a révélé que ces mutations améliorant la fonction se situent dans des régions clés de l’interface dimérique de la Rubisco, pouvant influencer la conformation ou l’environnement électrostatique de l’enzyme pour modifier ses performances catalytiques.
Principaux résultats
1. Caractérisation complète de la bibliothèque de mutants
L’équipe a réussi à construire et à cribler une bibliothèque de mutants de la Rubisco contenant 8 760 mutants à un seul acide aminé, couvrant 99 % des mutations possibles. Les résultats du criblage montrent que : - 72 % des mutants ont un impact négatif sur la fonction de la Rubisco. - 0,14 % des mutants présentent un fitness supérieur à celui de la forme sauvage, mais ces améliorations sont principalement liées au niveau d’expression protéique plutôt qu’à une augmentation de la vitesse catalytique.
2. Découverte de mutations améliorant la fonction
Grâce aux expériences de titration au CO₂, l’équipe a identifié plusieurs mutations capables d’améliorer significativement l’affinité de la Rubisco pour le CO₂, comme V266T et A102Y. Les valeurs de Kc de ces mutants sont 2 à 3 fois plus faibles que celles de la forme sauvage, indiquant une affinité accrue pour le CO₂. Les mesures d’activité enzymatique in vitro ont confirmé les propriétés biochimiques de ces mutants, mettant en évidence un compromis entre la vitesse catalytique et l’affinité pour le CO₂.
3. Révélation des relations structure-fonction
L’analyse structurale a montré que les mutations améliorant la fonction se situent dans des régions clés de l’interface dimérique de la Rubisco, pouvant influencer la conformation ou l’environnement électrostatique de l’enzyme pour modifier ses performances catalytiques. Par exemple, les mutations V266T et A102Y se trouvent près de l’axe de symétrie C2 de l’interface dimérique et pourraient améliorer l’affinité en influençant le chemin d’accès du CO₂ au site actif.
Conclusions et implications
1. Valeur scientifique
Cette étude, grâce au criblage à haut débit et à l’analyse systématique, a cartographié pour la première fois de manière exhaustive le paysage séquence-fonction de la Rubisco, révélant la diversité de ses fonctions biochimiques et les possibilités d’ingénierie. Les résultats montrent que, bien que l’espace fonctionnel de la Rubisco soit limité par divers compromis biochimiques, des améliorations significatives de ses performances peuvent être obtenues par des mutations à un seul acide aminé. Ces découvertes fournissent une base théorique importante pour l’optimisation future de la Rubisco.
2. Valeur appliquée
La Rubisco est une enzyme clé de la photosynthèse, et ses performances influencent directement l’efficacité de fixation du carbone et le rendement des cultures. Les mutations améliorant la fonction identifiées dans cette étude ouvrent de nouvelles perspectives pour la conception de Rubisco plus efficaces, avec des applications potentielles dans l’amélioration des cultures et le développement des biocarburants.
3. Points forts de l’étude
- Méthode de criblage à haut débit : Développement d’une méthode de criblage à haut débit basée sur une souche d’E. coli modifiée, permettant une caractérisation systématique des mutants de la Rubisco.
- Découverte de mutations améliorant la fonction : Identification de plusieurs mutations capables d’améliorer significativement l’affinité de la Rubisco pour le CO₂, dépassant les limites des connaissances traditionnelles.
- Révélation des relations structure-fonction : L’analyse structurale a révélé les mécanismes moléculaires des mutations améliorant la fonction, fournissant de nouvelles cibles pour l’ingénierie de la Rubisco.
Conclusion
Cette étude, grâce à des méthodes innovantes de criblage à haut débit et à une analyse systématique, a révélé de manière exhaustive les relations séquence-fonction de la Rubisco, identifiant plusieurs mutations capables d’améliorer significativement ses performances. Ces résultats fournissent une base théorique et expérimentale importante pour l’optimisation de la Rubisco et la recherche sur la photosynthèse. Cette avancée approfondit notre compréhension des fonctions de la Rubisco et ouvre de nouvelles possibilités pour l’amélioration des cultures et le développement des biocarburants.