高スループットな原位対逐次シーケンスによる細胞内解像度での空間マルチオミクス

2024-05-23 Thu
空間マルチオミクス高スループット原位対逐次シーケンス細胞内解像度遺伝子検出神経活動
サブセル解像度の空間多オミクスハイスループットインシチュペアシーケンシング研究背景と目的生物医学研究の進展に伴い、多オミクス技術は細胞機能や疾患メカニズムの理解においてますます注目されています。しかし、現在の多くのインシチュシーケンシング法は一種類の生体分子の空間情報の解読に限られ、多種の生体分子（例えば、DNA、RNA、タンパク質、小分子）の同時検出には課題が残っています。さらに、4n（4は4種類の蛍光染料、nはシーケンシングまたはハイブリダイゼーションの回数）デコード能力の制約により、ハイスループット空間オミクスはコストと検出効率の面でまだ改良の余地があります。この問題を解決するために、本論文では新しいハイスループットターゲットインシチュシーケンシング法である多オミクスインシチュペアシーケンシング（MIP-Seq）を報告します。この方法は脳組織中の多種の生体分子を効率的に検出し、分子と機能マッピングの多次元解析に新たな可能性を提供します。
論文出典この研究は華中農業大学のXiaofeng Wu、Weize Xu、Lulu Dengらによって執筆され、《Nature Biomedical Engineering》誌に掲載されました。論文のDOIはhttps://doi.org/10.1038/s41551-024-01205-7であり、受理日は2024年4月1日です。
研究のプロセスワークフローの詳細な説明この研究のワークフローは以下のステップを含みます：
1. プローブ設計とハイブリダイゼーション：
標的分子をマークするためのプローブを設計します。これにはパドロックプローブ、プライマー、検出プローブが含まれます。プローブは37°Cで一晩インキュベートされ、特異的な結合を達成します。
ライゲーションとローリングサークル増幅：
Splintr ligaseを使用して特異的なライゲーションを行い、ローリングサークル増幅テンプレートを形成します。次に、30°Cで2時間のローリングサークル増幅（RCA）を行い、信号を増幅します。
ハイスループットシーケンシングと信号デコード：
ペアシーケンシング戦略を利用し、各シーケンシングラウンドで2つのバーコードペアを同時にデコードします。これにより、遺伝子検出のスループットが大幅に向上し、シーケンシングラウンド数とコストが削減されます。各シーケンシング後、高感度な顕微鏡イメージング技術を用いて蛍光信号を記録します。
画像処理とデータ解析：
ディープラーニング補助のイメージ解析技術を使用し、複数のシーケンシング画像の間でアライメント、デコード、細胞セグメンテーションを行います。
主要な実験結果RNA検出効率：
MIP-Seqを用いてヒトのGAPDHおよびMTOR遺伝子転写を検出した結果、MIP-Seqの検出効率はhcr3.0-FISH法の96%に達することが示されました。
遺伝子発現パターンの空間マッピング：
マウス脳組織において、MIP-SeqでKIF5AおよびSNHG11遺伝子の空間発現パターンを検出し、それぞれ細胞質および細胞核に局在することを確認しました。
多重遺伝子検出と三次元再構築：
MIP-Seqを用いて、マウス脳の縦断切片全体でCALB1、GAD1、PLP1など10個の遺伝子を検出し、これらの遺伝子の脳内の三次元発現構造を構築しました。
結論と意義MIP-Seqはハイスループットおよび多オミクスインシチュ検出において大きな可能性を示し、DNA、RNAだけでなく、タンパク質や神経伝達物質など多種の生体分子を検出することができます。この方法は高スループットと単一ヌクレオチド検出の精度により、細胞機能研究、疾患メカニズムの探索、精密がん診断など多くの分野に応用できます。
研究のハイライト高デコード能力：MIP-Seqのダブルバーコードペアシーケンシングにより、シーケンシング能力が大幅に向上（10n vs 4n）。
多オミクス応用：DNA、RNA、タンパク質、神経伝達物質など多種の生体分子のハイスループットインシチュ共検出を実現。
実験コストの削減：シーケンシングラウンド数とイメージング時間の削減により、実験コストが大幅に低減。
その他の重要内容研究の過程で、MIP-Seqは腫瘍遺伝子変異の検出や親本遺伝子特異的発現の識別、エピジェネティック修飾の検出に利用されました。また、MIP-Seqはカルシウムイメージングおよびラマン分光イメージングと組み合わせることで、機能活性と遺伝子発現プロファイルの統合を同一細胞内で実現し、将来の多次元オミクス研究に新たな指針を提供します。MIP-Seqはハイスループットかつ多次元の組織および細胞解析に強力で柔軟なプラットフォームを提供し、その広範な応用可能性はより複雑な生物学的メカニズムの解明や精密医療の推進に役立ちます。