マトリックス剛性が内皮細胞のDNAメチル化に及ぼす影響
病理条件下では、組織の力学的特性の変化は、がんを含む多くの疾患の顕著な特徴の一つです。腫瘍血管系は腫瘍の成長において重要な役割を果たしますが、その構造と機能はしばしば異常を示し、血管の乱れ、屈曲、漏出などが観察されます。研究によると、細胞外マトリックス（Extracellular Matrix, ECM）の硬さは内皮細胞の行動を調節する上で重要な役割を果たしています。腫瘍組織は通常、正常組織よりも硬く、この硬さの増加はマトリックスの沈着や架橋の増加に一部起因しています。これまでの研究では、マトリックスの硬さを低下させることで、腫瘍血管系の病理的特徴（例えば、血管新生の減少や血管透過性の低下）を改善できることが示されています。したがって、マトリックスの硬さが内皮細胞のエピジェネティックな変化、特にDNAメチル化にどのように影響するかを理解することは、腫瘍血管系の病理メカニズムを解明する上で重要です。
DNAメチル化はエピジェネティックなメカニズムの一つであり、メチル基をDNAのシトシンに共有結合させることで遺伝子発現を調節します。内皮細胞では、DNAメチル化の異常が動脈硬化などの疾患の発症と進行に関連しています。近年、メカノバイオロジーとエピジェネティクスの交差点に関する研究が注目を集めており、特にマトリックスの硬さがDNAメチル化にどのように影響するかはまだ不明です。そこで、本研究はマトリックスの硬さが内皮細胞のDNAメチル化に及ぼす影響を探り、その分子メカニズムを明らかにすることを目的としています。
論文の出典
本論文は、Paul V. Taufalele、Hannah K. Kirkham、およびCynthia A. Reinhart-Kingによって共同執筆されました。彼らはそれぞれVanderbilt UniversityとRice Universityの生物医学工学科に所属しています。論文は2025年1月17日に『Cellular and Molecular Bioengineering』誌にオンライン掲載され、DOIは10.1007/s12195-024-00836-9です。
研究の流れと結果
研究の流れ
細胞培養とマトリックスの準備
研究では、ヒト臍帯静脈内皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs）を対象としました。HUVECsは、コラーゲンでコーティングされたポリアクリルアミドゲル（Polyacrylamide, PA）上に播種され、ゲルの硬さはそれぞれ2.5 kPaと20 kPaとし、腫瘍微小環境の硬さ範囲を模倣しました。細胞はゲル上で5日間培養され、単層を形成しました。DNAメチル化の検出
DNAメチル化レベルは、5-メチルシトシン（5-methylcytosine）の免疫蛍光染色とELISA（酵素結合免疫吸着測定法）によって評価されました。免疫蛍光染色は細胞核内の5-メチルシトシン信号を検出するために使用され、ELISAはゲノムDNA中の5-メチルシトシンレベルを定量するために使用されました。遺伝子発現の分析
定量PCR（qPCR）を用いて、DNAメチル化に関連する酵素遺伝子（DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、TET1、TET2）の発現レベルを測定しました。時間的ダイナミクスの分析
マトリックスの硬さがDNAメチル化に及ぼす影響を時間的に調べるため、HUVECsのDNAメチル化レベルを異なる時間点（24時間、48時間、72時間、96時間、120時間）で測定しました。さらに、継代（passaging）がDNAメチル化レベルに及ぼす影響も評価しました。
主な結果
マトリックスの硬さがDNAメチル化に及ぼす影響
研究では、柔らかいマトリックス（2.5 kPa）と比較して、硬いマトリックス（20 kPa）上で培養されたHUVECsでは、全体的なDNAメチル化レベルが有意に低下することが明らかになりました。免疫蛍光染色とELISAの結果はこの発見を裏付けており、マトリックスの硬さの増加がDNAメチル化の減少を引き起こすことを示しています。DNMT1発現の低下
qPCRの結果、DNMT1遺伝子の発現は硬いマトリックス上で有意に低下し、他のDNAメチル化関連酵素（DNMT3A、TET1、TET2）の発現レベルには有意な変化は見られませんでした。DNMT1はDNAメチル化パターンを維持する重要な酵素であり、その発現低下がDNAメチル化レベルの低下の一因である可能性があります。DNAメチル化の時間的ダイナミクス
時間的ダイナミクスの分析では、硬いマトリックス上でのDNAメチル化レベルは培養24時間後に有意に低下し、時間の経過とともに両方の硬さ条件下でDNAメチル化レベルが徐々に低下しましたが、差異は依然として有意でした。さらに、継代プロセスはDNAメチル化レベルを有意に増加させ、細胞がマトリックスから離脱した後に何らかのメカニズムを通じてメチル化状態を再確立する可能性を示唆しています。
結論と意義
本研究は、マトリックスの硬さが内皮細胞のDNAメチル化に及ぼす顕著な影響を明らかにし、特に硬いマトリックス上では全体的なDNAメチル化レベルが有意に低下することを示しました。この発見は、腫瘍微小環境における血管内皮細胞のエピジェネティックな変化を理解するための新たな視点を提供します。さらに、DNMT1の発現低下がDNAメチル化レベルの低下の主要な要因である可能性が示されました。これらの結果は、細胞培養においてマトリックスの力学的特性を考慮することの重要性を強調しており、体外実験が体内環境を正確に模倣することを保証するためのものです。
本研究の科学的価値は、マトリックスの硬さとDNAメチル化との直接的な関連性を明らかにし、腫瘍血管系の病理メカニズムに対する新たな説明を提供することにあります。さらに、腫瘍マトリックスの硬さを標的とした治療戦略の開発に対する理論的根拠を提供し、潜在的な応用価値を持っています。
研究のハイライト
重要な発見
研究は初めて、マトリックスの硬さが内皮細胞のDNAメチル化に直接影響を与えることを証明し、特に硬いマトリックス上では全体的なDNAメチル化レベルが有意に低下することを示しました。研究方法の革新性
研究では、コラーゲンでコーティングされたポリアクリルアミドゲルを細胞培養のマトリックスとして使用し、腫瘍微小環境の硬さ範囲を成功裏に模倣しました。さらに、免疫蛍光染色とELISAを組み合わせた方法により、DNAメチル化レベルを正確に検出しました。研究対象の特殊性
研究は内皮細胞に焦点を当てており、この細胞は腫瘍血管系の形成と機能において重要な役割を果たすため、腫瘍血管系の病理メカニズムを理解するための新たな視点を提供します。
その他の価値ある情報
研究では、継代がDNAメチル化レベルに及ぼす影響も探り、継代プロセスがDNAメチル化レベルを有意に増加させることを発見しました。この発見は、細胞がマトリックスから離脱した後のエピジェネティックな変化を理解するための新たな手がかりを提供し、細胞培養や腫瘍転移の研究にとって重要な意義を持つ可能性があります。