ERP57のALS関連変異TDP43に対する神経細胞での保護作用研究

はじめに

筋萎縮性側索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis、ALS）は、運動ニューロンに影響を与える重篤な神経変性疾病です。ほぼすべてのALS症例（97%）と約50%の前頭側頭型認知症（FTD）症例において、病理学的形態のTar-DNA結合タンパク質-43（TDP-43）が存在し、これはTDP-43が神経変性疾患において重要な役割を果たしていることを示しています。以前の研究では、小胞体タンパク質57（ERP57）、タンパク質ジスルフィド異性化酵素（Protein Disulphide Isomerase、PDI）ファミリーのメンバーが、ALS関連の変異型スーパーオキシドジスムターゼ1（SOD1）マウスモデルにおいて保護作用を示すことが発見されました。しかし、ERP57がALSにおける特異的な病理学的TDP-43に対して保護作用を持つかどうかはまだ明らかではありません。本研究の目的は、ERP57がTDP-43の病理学的プロセスにおいて果たす役割を探索し、潜在的な治療標的としての可能性を評価することです。

研究ソース

本論文はMacquarie University Motor Neuron Disease Research CentreのSonam Parakh、Emma R. Perri、Marta Vidalらの共同研究によって完成し、「Neuromolecular Medicine」に掲載されました。論文は2023年11月16日に受理され、2024年4月9日に採択されました。Julie D. Atkin教授が本研究の主要責任者です。

研究プロセス

研究対象と方法

細胞株：

研究ではマウスNeuro-2a神経芽細胞腫細胞株（オーストラリアCellBank由来）を使用し、10%ウシ胎児血清（FCS）を含むDulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）培地で、37°C、5% CO_2環境下で培養しました。

構築と遺伝子導入：

ERP57を含むpCDNA3.1(+)プラスミドを使用し、これはグラスゴー大学のDr Neil Bulleidから提供されました。また、Turbo-GFPタグ付きのTDP-43野生型と変異体TDP-43m337v（pCMV6-AC-GFP由来）も使用しました。遺伝子導入実験にはLipofectamine-2000（Invitrogen）を使用し、製造元のプロトコルに従って実施しました。

免疫細胞化学と顕微鏡観察：

神経細胞は4%パラホルムアルデヒド（PFA）で固定し、PBS中で0.1% Triton-Xを用いて透過処理を行いました。その後、様々な一次抗体と二次抗体で染色し、最後にHoechst 33342で核を染色しました。その後、蛍光顕微鏡を用いて細胞を観察し、データを記録しました。

研究の主要ステップ

1. 問題定義と仮説の提示：

目標は、ERP57がALS関連の変異TDP-43に対して保護作用を持ち、神経細胞における異常局在と凝集を防ぐことができるかどうかを確認することでした。

2. 細胞株実験：

TDP-43とERP57のタグ付き細胞株をそれぞれ構築し、免疫細胞化学と蛍光顕微鏡を用いて細胞を観察しました。主にTDP-43の局在、封入体形成、ER応答反応、そして細胞アポトーシスを観察しました。

データ分析と結果

TDP-43の定常状態レベルの低下：

研究ではまず、ERP57が神経細胞においてTDP-43の病理に対して保護作用を持つかどうかを観察しました。共焦点蛍光顕微鏡を用いて72時間の遺伝子導入観察を行い、ERP57とTDP-43が遺伝子導入細胞の99%で共発現していることを発見しました。ウエスタンブロッティングでは、ERP57存在下で野生型と変異型TDP-43の定常状態レベルが低下していることが示されました。特に、より低い発現レベルで顕著でした（*p < 0.05）。

ERP57によるTDP-43の異常局在の防止：

次に、ERP57とTDP-43m337vを共発現させた際のTDP-43の細胞内局在を観察しました。実験結果は、ERP57が細胞質におけるTDP-43の異常局在を有意に減少させることを示しました（*p < 0.05）。これは、ERP57が変異TDP-43の誤った局在を防ぐことができることを示しています。

ERP57による変異TDP-43の封入体形成の抑制：

共焦点蛍光顕微鏡を用いた細胞の定量分析により、ERP57の共発現が変異TDP-43m337vを持つ細胞における封入体形成を有意に減少させることが示されました。さらなる3D画像分析では、ERP57の共発現が封入体を有意に縮小させることが示され、ERP57がTDP-43の誤った折りたたみを防ぐ役割を果たしていることが示唆されました。

ERP57によるER応答反応と細胞アポトーシスの低減：

免疫細胞化学により、ERP57が変異TDP-43によって誘導されるER応答反応（CHOP免疫反応）と細胞アポトーシス（断片化または凝集した核）を有意に低減させることが示されました。

結論と重要な発見

本研究の主な発見は以下の通りです：

1. ERP57は、変異TDP-43の細胞質における異常局在を有意に減少させ、封入体の形成とその大きさを減少させることができます。
2. ERP57は、変異TDP-43によって引き起こされるER応答反応と細胞アポトーシスを低減させ、保護作用を示します。
3. ERP57は、折りたたみ経路の分子シャペロンとして機能し、TDP-43の正しい折りたたみと機能の維持を助ける可能性があります。

本研究は、ERP57がALS関連のTDP-43病理において保護作用を持つことを初めて示し、神経変性疾患におけるPDIファミリーメンバーの重要な役割をさらに強調しました。ERP57は潜在的な治療標的として、ALS、FTDなどの関連神経変性疾患の治療に新たな視点を提供する可能性があります。

意義と今後の研究方向

本研究は、ALSにおけるERP57の保護メカニズムと潜在的な治療応用を理解するための新たな視点を提供しました。今後の研究では、ERP57の生体内ALSモデルにおける役割をさらに探索し、具体的な分子メカニズムとタンパク質相互作用ネットワークを特定することが考えられます。また、ERP57の他の神経変性疾患における適用可能性を検討し、より広範な臨床応用における潜在的可能性を探ることも提案されています。