构建人类3D纹状体-黑质体神经样器官以模拟亨廷顿病中中型棘状神经元投射缺陷

2024-05-23 Thu
构建人类3D纹状体-黑质体神经样器官以模拟亨廷顿病中中型棘状神经元投射缺背景介绍亨廷顿病（HD）是一种导致运动系统明显衰退的神经退行性疾病，主要特征是由纹状体（striatum）到中脑黑质（substantia nigra，SN）的中型多棘神经元（medium spiny neurons，MSNs）投射缺陷。然而，研究亨廷顿病病理生理学面临的挑战之一是缺乏有效的人类模型，特别是能够模拟这些神经回路缺陷的体外模型。尽管HD的病因已知是由亨廷顿基因（huntingtin gene）中的异常扩展的CAG重复所致，但有效的治疗方法仍然欠缺，这可能部分归因于缺乏类似物模型用于药理学研究。

在亨廷顿病患者中，纹状体-黑质（striatum-substantia nigra，STR-SN）回路功能障碍会导致一系列与运动相关的症状。近年来，从人类多能干细胞（human pluripotent stem cells，hPSCs）分化而来的人类大脑类器官（organoids）被认为是研究人脑发育和大脑疾病病理生成的有前景的实验模型。然而，尽管利用区域特异性大脑类器官的技术取得了一些成功，但模拟STR-SN微回路的类器官组合体（assembloids）仍未完全建立。
文章来源与作者信息本文由Shanshan Wu、Yuan Hong、Chu Chu、Yixia Gan、Xinrui Li、Mengdan Tao、Da Wang、Hao Hu、Zhilong Zheng、Qian Zhu、Xiao Han、Wanying Zhu、Min Xu、Yi Dong、Yan Liu和Xing Guo共同完成，发表于2024年5月21日的Proceedings of the National Academy of Sciences（PNAS，doi: 10.1073/pnas.2316176121）。文章没有利益冲突并公开发布在PNAS Direct Submission上。相关文章的编辑是来自Johns Hopkins University School of Medicine的Ted M. Dawson。
研究方法研究流程人类纹状体类器官的生成：首先，根据先前的报道从hPSCs中分化得到功能性的MSNs。研究人员修改并优化了一种分化方案，通过在早期用Sonic Hedgehog（SHH）处理神经上皮细胞，促使其分化为包含纹状体投射神经元的侧面膝状突起前体细胞（LGE）。
3D STR-SN结合类器官的构建：通过将纹状体类器官与SN类器官融合，生成三维（3D）STR-SN类器官组合体。研究者通过AAV-HSyn-GFP介导的病毒示踪，观察到了来自纹状体类器官的MSNs向SN类器官的广泛投射，并与SN类器官中的GABA能神经元形成突触连接。
HD病人来源的iPSCs类器官生成与融合：进一步生成亨廷顿病患者源的自诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）形成的类器官，并构建HD的STR-SN类器官组合体。
具体实验步骤纹状体类器官分化：通过不同浓度的SHH进行处理，找到最佳的分化条件，使细胞在D30和D60分别表现出LGE前驱标志物NKX2.1和GABA能神经元标志物GAD67的表达。
RNA测序（scRNA-Seq）：对D30和D60的纹状体类器官进行scRNA-Seq，以验证这些类器官的区域特异性。
融合类器官的生成与验证：将标记有GFP的纹状体类器官与SN类器官融合，生成STR-SN组合体，并通过免疫荧光和电子显微镜等手段验证其突触连接。
钙成像和电生理学检测：利用钙成像和光遗传学技术，检测类器官中神经元的功能性突触连接。
研究结果纹状体类器官生成在D30和D60，这些类器官表现出纹状体区分化特有的基因表达模式和功能性成纤维细胞样电流（图1C-E）。
RNA测序结果显示，类器官中的MSNs具有与人类胎儿大脑纹状体相似的转录组特征。电生理记录显示，这些细胞具有典型的快速、失活的内流和外流电流以及自发的节律性放电。
3D STR-SN组合体的构建与功能检测通过光遗传学和全细胞补片记录，证实了MSNs在组合体中与GABA能神经元和多巴胺能神经元形成功能性的突触连接。融合类器官的钙活性显著增强，与单独的纹状体类器官相比，显示了更高的功能成熟度。
HD病人来源的类器官与组合体生成了三株HD患者来源的iPSCs纹状体类器官，观察到明显的mHTT聚集特征（图2B-E），并且这些类器官中MSNs的数量显著减少。在D30时，HD类器官中细胞的增殖能力明显下降，凋亡细胞比例显著增加。
HD类器官组合体的钙信号显著下降，光遗传学记录和电生理检测显示这些组合体的神经活动显著降低，表明HD患者的神经元连接和功能存在明显的缺陷（图3A-F，4A-C）。
药物治疗研究探讨了脑源性神经营养因子（BDNF）对HD类器官的治疗效果，结果显示BDNF显著改善了HD类器官中MSNs的数量和功能，且神经元投射和钙信号恢复到接近对照水平（图4G-K）。
研究结论和意义通过构建人类STR-SN组合体，本研究提供了一个在人类源的体外平台，用于研究亨廷顿病中STR-SN回路缺陷。该平台不仅为其他神经退行性疾病提供了参考价值和指导意义，还展示了其在潜在药物测试中的应用潜力。未来的研究可以继续利用这种平台探索各种神经精神疾病的发展和神经连通性，推动相关治疗策略的研究。
研究亮点创新：首次建立了人类源性的STR-SN组合体，成功模拟了体内的神经回路缺陷。
多样性：包括了不同来源的iPSCs，为不同病理研究提供了广泛的应用潜力。
药物测试：证明了该组合体在药物测试中的可靠性和有效性，特别是在BDNF治疗HD中的应用。
其他有价值的信息本研究由中国的多个研究资助项目支持，包括国家重点研发计划和国家自然科学基金等。此外，所有原始的和处理过的单细胞RNA测序数据已存储在Gene Expression Omnibus（GEO）数据库中，研究数据公开透明，方便其他研究人员参考利用。
通过此次研究，研究团队为HD以及其他神经退行性疾病的研究提供了一个强有力的工具和平台，将有助于进一步理解这些疾病的发病机制并推动新疗法的开发和实施。