工程化染色体外癌基因扩增促进肿瘤发生
学术背景与问题提出
在癌症研究中，基因扩增（gene amplification）是一种常见的突变形式，尤其是在癌基因（oncogene）的激活中起着关键作用。然而，尽管基因扩增在癌症中的重要性已被广泛认可，但如何在原代细胞和模式生物中精确模拟这些扩增仍然是一个挑战。特别是，染色体外DNA（extrachromosomal DNA, ecDNA）介导的基因扩增在癌症中尤为常见，但其在肿瘤发生和进展中的具体作用尚未完全阐明。ecDNA是一类不依赖于染色体的环状DNA分子，通常携带多个癌基因拷贝，能够通过随机分离在细胞分裂中快速积累，从而促进肿瘤的异质性和进化。
为了深入理解ecDNA在肿瘤发生中的作用，研究人员需要一种能够在细胞和动物模型中精确诱导和追踪ecDNA形成的方法。然而，现有的技术手段在模拟ecDNA介导的基因扩增方面存在诸多限制。因此，本研究旨在开发一种通用的策略，能够在细胞和小鼠中时空可控地诱导大片段（超过1 Mbp）的ecDNA扩增，并利用这一策略研究ecDNA在肿瘤发生中的具体机制。
论文来源与作者信息
本论文由Davide Pradella、Minsi Zhang、Rui Gao等16位作者共同完成，主要来自Memorial Sloan Kettering Cancer Center、Stanford University、UC San Diego等多家知名研究机构。论文于2024年10月31日在线发表在《Nature》期刊上，题为“Engineered extrachromosomal oncogene amplifications promote tumorigenesis”。
研究流程与实验设计
1. ecDNA工程化策略的开发
为了模拟人类癌症中常见的ecDNA扩增，研究人员设计了一种基于Cre-loxP系统的策略。通过将ecDNA的形成与选择性标记的表达相结合，研究人员能够在生理条件下和特定选择压力下追踪ecDNA的动态变化。具体而言，研究人员设计了两个“环化盒”（circularization cassettes），分别插入到目标基因区域的两端。当Cre重组酶表达时，loxP位点之间的基因组区域被切除并环化，形成ecDNA。同时，环化盒中的荧光标记（如H2B-GFP和mScarlet）能够帮助研究人员追踪ecDNA的存在和动态变化。
2. 在细胞中验证ecDNA的形成与动态
研究人员首先在HCT116结肠癌细胞系中验证了这一策略。通过CRISPR-Cas9基因编辑技术，研究人员在染色体12上插入了一个1.5 Mbp的区域，该区域包含MDM2癌基因。当Cre重组酶表达时，研究人员成功诱导了ecDNA的形成，并通过流式细胞术和荧光显微镜观察到了ecDNA的动态变化。此外，研究人员还通过浅层全基因组测序（shallow whole-genome sequencing, SWGS）和定量PCR（qPCR）验证了ecDNA的存在和扩增。
3. 在小鼠模型中诱导ecDNA的形成
为了进一步研究ecDNA在体内的作用，研究人员构建了携带loxP位点的小鼠模型，这些loxP位点位于染色体15上的MYC基因区域。通过Cre重组酶的诱导，研究人员成功在小鼠的原代细胞中诱导了MYC-containing ecDNA的形成，并观察到这些ecDNA在细胞中的自发积累。此外，研究人员还构建了携带MDM2-containing ecDNA的小鼠模型，并发现这些ecDNA能够促进原代细胞的增殖、永生化以及转化。
4. ecDNA在肿瘤发生中的作用
为了验证ecDNA在肿瘤发生中的具体作用，研究人员在自发性肝癌小鼠模型中诱导了MDM2-containing ecDNA的形成。结果显示，携带ecDNA的小鼠在MYC基因的驱动下，能够自发形成肝癌。这一结果直接证明了ecDNA在肿瘤发生中的重要作用，并为研究ecDNA驱动的肿瘤提供了新的动物模型。
主要研究结果
ecDNA的形成与动态追踪：研究人员成功开发了一种能够在细胞和小鼠中精确诱导ecDNA形成的策略，并通过荧光标记和基因组测序技术追踪了ecDNA的动态变化。
ecDNA促进细胞增殖与永生化：在携带MYC和MDM2-containing ecDNA的小鼠原代细胞中，研究人员观察到ecDNA的自发积累，并发现这些ecDNA能够促进细胞的增殖和永生化。
ecDNA在肿瘤发生中的作用：在自发性肝癌小鼠模型中，研究人员发现MDM2-containing ecDNA能够促进肿瘤的形成，进一步验证了ecDNA在肿瘤发生中的重要作用。
结论与意义
本研究开发了一种通用的策略，能够在细胞和小鼠中精确诱导ecDNA介导的基因扩增，并利用这一策略深入研究了ecDNA在肿瘤发生中的具体机制。研究结果表明，ecDNA能够在原代细胞中自发积累，并促进细胞的增殖、永生化以及肿瘤的形成。这一发现不仅为理解ecDNA在肿瘤发生中的作用提供了新的见解，还为开发新的临床前免疫活性小鼠模型提供了重要工具。
研究亮点
创新性策略：本研究首次开发了一种能够在细胞和小鼠中精确诱导ecDNA形成的策略，为研究ecDNA的生物学功能提供了新的工具。
ecDNA在肿瘤发生中的作用：研究直接证明了ecDNA在肿瘤发生中的重要作用，为理解肿瘤的异质性和进化提供了新的视角。
应用价值：本研究为开发新的临床前小鼠模型提供了重要工具，未来可以用于研究ecDNA驱动的肿瘤的免疫治疗和靶向治疗。
其他有价值的信息
本研究还揭示了ecDNA在细胞中的动态变化及其与肿瘤发生的关系，为未来的癌症研究提供了新的方向。此外，研究人员还发现ecDNA的积累与特定的选择压力密切相关，这为理解肿瘤的耐药性提供了新的线索。