基于纳米孔测序技术的血流感染病原体识别与抗生素耐药性预测研究

学术背景

血流感染（Bloodstream Infections, BSI）是一种严重的临床疾病，通常通过血培养阳性结果和全身性感染症状来诊断。血流感染可以由多种病原体引起，包括细菌、真菌和病毒，且其发病率在全球范围内呈上升趋势。随着抗生素的广泛使用，多重耐药（Multidrug-Resistant, MDR）微生物的出现使得血流感染的治疗变得更加复杂和具有挑战性。传统的病原体识别和抗生素敏感性测试（Antimicrobial Susceptibility Testing, AST）通常需要2-5天的时间，这在一定程度上延误了患者的治疗时机。

近年来，快速AST设备的出现（如Accelerate PhenoTest BC系统和Q-linea ASTar系统）将检测时间缩短至6-7小时，但这些设备在流行病学信息提供方面仍存在局限性。基因组测序技术，尤其是纳米孔测序技术（Nanopore Sequencing），因其能够实时分析长DNA或RNA片段，逐渐成为病原体识别和抗生素耐药性（Antimicrobial Resistance, AMR）基因分型的有力工具。然而，由于血培养样本中人类DNA的高丰度，病原体的覆盖度较低，限制了其直接应用的可行性。为此，牛津纳米孔技术公司（Oxford Nanopore Technologies, ONT）引入了自适应采样（Adaptive Sampling）技术，能够在测序过程中实时去除人类DNA，从而提高病原体的检测效率。

本研究旨在评估纳米孔测序结合自适应采样技术在血流感染病原体识别和抗生素耐药性预测中的可行性和性能，探索其在临床实践中的应用潜力。

论文来源

本论文由Po-Yu Liu、Han-Chieh Wu、Ying-Lan Li、Hung-Wei Cheng、Ci-Hong Liou、Feng-Jui Chen和Yu-Chieh Liao共同完成，作者分别来自台湾台中荣民总医院、台湾国家卫生研究院、台湾阳明交通大学等机构。该研究于2024年发表在Genome Medicine期刊上，题为《Comprehensive pathogen identification and antimicrobial resistance prediction from positive blood cultures using nanopore sequencing technology》。

研究流程与方法

样本收集与常规检测

研究从台湾中部地区的血流感染患者中收集了458份阳性血培养样本。所有样本均在BD BACTEC™ FX系统中进行培养，并使用MALDI-TOF VITEK MS（生物梅里埃公司）进行病原体鉴定，抗生素敏感性测试则通过VITEK 2系统完成。研究还纳入了6份阴性对照样本，以评估细菌DNA污染的背景水平。

DNA提取与纳米孔测序文库构建

从每份阳性血培养样本中提取DNA，使用QIAamp Biostic Bacteremia DNA Kit（Qiagen公司）在QIAcube Connect自动化设备上进行提取。提取的DNA通过ONT Rapid Barcoding Kit 96构建测序文库，并在GridION SpotON流动池（R9.4.1）上进行测序。测序过程中启用了自适应采样模式，以去除人类DNA。

生物信息学分析

研究开发了一套生物信息学分析流程，使用Centrifuge 1.0.4对测序数据进行物种分类，并通过Flye 2.9.2进行基因组组装。抗生素耐药性预测则通过ResFinder 4.3.2和PointFinder完成。研究还使用PacBio Sequel IIe系统对多微生物感染样本进行了全长16S rRNA测序验证。

主要研究结果

病原体识别

研究共识别出76种病原体，包括88株大肠杆菌（Escherichia coli）、74株肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、43株金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和9株念珠菌（Candida）。纳米孔测序不仅能够准确识别单一微生物感染，还能够检测到23份多微生物感染样本，并通过全长16S rRNA测序进一步验证。

抗生素耐药性预测

使用改进的ResFinder数据库，纳米孔测序在单一微生物感染样本中的抗生素耐药性预测分类一致率超过90%（3799/4195），且对肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌的预测误差率极低（分别为1.1%和1.1%）。

研究结论

研究表明，纳米孔测序结合自适应采样技术能够直接从阳性血培养样本中快速识别病原体并预测抗生素耐药性，为血流感染的诊断和治疗提供了革命性的工具。该技术的应用有望显著改善抗生素管理策略，提升患者治疗效果。

研究亮点

1. 快速病原体识别：纳米孔测序能够在1小时内完成病原体识别，15小时内提供全面的抗生素耐药性预测。
2. 多微生物感染检测：该技术能够有效检测多微生物感染，为复杂感染病例的诊断提供了新的可能性。
3. 高精度抗生素耐药性预测：改进的ResFinder数据库显著提高了抗生素耐药性预测的准确性，尤其是对关键病原体的预测误差率极低。
4. 临床应用潜力：该技术的快速性和准确性使其在临床实践中具有广泛的应用前景，尤其是在血流感染的早期诊断和抗生素管理方面。

研究意义与价值

本研究展示了纳米孔测序技术在血流感染病原体识别和抗生素耐药性预测中的巨大潜力。通过实时去除人类DNA，该技术能够显著提高病原体的检测效率，为临床医生提供更快速、更准确的诊断信息。这不仅有助于优化抗生素的使用，减少耐药性的发展，还能够改善患者的治疗效果，降低医疗成本。未来，随着纳米孔测序技术的进一步发展和成本的降低，其在临床诊断中的应用将更加广泛。

其他有价值的信息

研究还探讨了纳米孔测序技术与其他快速AST设备的比较，指出其在病原体识别范围和基因组信息提供方面的优势。此外，研究还提出了将该技术整合到临床工作流程中的实际考虑因素，包括成本、人员培训和监管审批等。

本研究为血流感染的诊断和治疗提供了新的工具和方法，具有重要的科学和应用价值。