人类小胶质细胞的形态特异性钙信号

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人类小胶质细胞 体外人脑组织模型 小胶质细胞微环境 常驻小胶质细胞形态类型 miRNA-9辅助标记

人类小胶质细胞中形态特异性的钙信号特性研究

背景与研究目的

小胶质细胞是中枢神经系统(CNS)的主要免疫细胞，参与几乎所有的生理和病理过程，包括发育、突触传递、神经可塑性、睡眠、创伤、胶质母细胞瘤和神经退行性疾病等。此外，小胶质细胞通过感应危险相关分子模式(DAMPs)和病原相关分子模式(PAMPs)来监测其微环境。小胶质细胞通过表达大量编码不同膜受体的基因（称为“小胶质细胞感受体组”），检测胞内钙离子浓度变化，从而触发细胞因子和其他炎症因子的生成和释放，以及细胞增殖、分化、迁移和吞噬作用。在小鼠模型中，小胶质细胞的钙瞬变信号与神经网络活动密切相关，具有明显的空间分区特性。然而，人类小胶质细胞的钙信号特性仍然未知，且多数研究局限于培养的原代细胞或诱导多能干细胞（iPSC）衍生的小胶质样细胞。

论文来源及作者

本研究由Sofia Nevelchuk等人完成，作者主要来自德国图宾根大学神经生理学系（Department of Neurophysiology, Institute of Physiology, Eberhard Karls University of Tübingen）、赫提临床脑研究所（Hertie Institute for Clinical Brain Research, University of Tübingen）及位于马丁斯里德的马普生物智能研究所（Max-Planck-Institute for Biological Intelligence, Martinsried）。论文发表在2024年《Journal of Neuroinflammation》期刊。

研究方法与工作流程

组织样本的准备与培养

研究样本取自6位患者在外科手术中切除的皮层组织，这些切除组织随后用于制备有机型皮层切片。这些切片保存在冰冷的人工脑脊液中，并在1-2小时内被转移到培养膜上，随后用人类脑脊液（hCSF）培养。使用长度为1.5mm的神经干细胞培养基进行培养，并每3天更换一次hCSF。研究期间，切片通过慢病毒载体转导，表达三种不同颜色的荧光蛋白（mCherry, mVenus, mTurquoise2）和新开发的遗传编码钙指示剂mcyrfp1-caneon，以标记和分析小胶质细胞的钙信号。

新型钙指示剂的开发与性能评估

为了监测人类小胶质细胞中的钙信号，研究团队开发了一种新型遗传编码的比率钙指示剂mcyrfp1-caneon。该指示剂结合了黄色-绿色荧光蛋白mNeonGreen和红色荧光蛋白mcyrfp1，能够在单光子和双光子模式下进行钙成像。与目前流行的GCaMPs相比，caneon的荧光蛋白亮度更高，并且仅有两个钙结合位点，提供了更好的线性和降低钙缓冲负荷。

钙信号检测与数据分析

研究使用MATLAB的Begonia框架进行钙信号的活动像素检测和分析。每个像素的荧光值被转换为二进制时间序列，使用经验确定的阈值识别活动像素，并将这些像素分组，定义为活动区域（ROA）。然后计算caneon和mcyrfp1在每个时间点的平均荧光值，进而计算并分析钙瞬变变化的比例（δR/R）。

主要研究结果

不同形态小胶质细胞的钙信号特性

本研究发现人类小胶质细胞存在显著的钙信号分区特性，不同形态的细胞钙信号特性各异。研究从以下几方面详细描述了钙信号的特性：

  1. 基础钙水平：研究显示，在人类小胶质细胞中，基础钙水平在不同形态的细胞间存在显著差异。树枝状小胶质细胞的基础钙水平最低，而变形小胶质细胞的基础钙水平则显著升高。

  2. 钙信号分布与频率：钙信号在树枝状细胞中多局限于细胞过程区域，而在变形细胞中，大部分钙信号分布于细胞体。进一步分析发现，树枝状细胞的过程钙瞬变具有高幅度和短持续时间的特性，而变形细胞的钙瞬变则具有高幅度但长期持续的特性。

  3. 活动区域（ROAs）特性：在树枝状细胞中，钙信号活动区域较小且主要集中在细胞过程；而在变形细胞中，活动区域较大且主要位于细胞体。钙瞬变的 amplitudes 和AUC 在三种细胞形态中均不同，尤其是在树枝状和变形细胞中差异明显。

钙信号的动力学特性

  1. 频率与振荡行为：在树枝状和肥大（hypertrophic）细胞中，钙信号频率相对较低，而变形细胞中常见钙信号振荡现象，频率大约为12.33×10^-3 s^-1。
  2. 运动与钙瞬变关联：许多树枝状和肥大细胞显示出显著的过程运动，相关区域显示出局部的钙瞬变；尽管在15分钟的记录期内未发现细胞体的位移。

研究结论与价值

这项研究通过使用新型遗传编码钙指示剂、先进的钙信号检测与分析技术，深入分析了人类小胶质细胞（包括树枝状、肥大和变形形态）在其原生态环境中的钙信号特性。研究发现的钙信号不同分区特性，为理解小胶质细胞在生理和病理过程中发挥的具体功能提供了重要线索，对未来针对神经系统疾病的研究具有重要指导意义。此外，新的技术手段，如RGB标记法和新型钙指示剂mcyrfp1-caneon，为进一步研究人类小胶质细胞提供了强有力的工具。该研究填补了人类小胶质细胞钙信号动态变化方面的空白，并展示了其在不同形态下的功能异质性。

研究亮点

  1. 新型遗传编码钙指示剂：开发了适用于单光子和双光子钙成像的新型比率钙指示剂mcyrfp1-caneon，具备高亮度和良好的线性，是现有人类小胶质细胞钙成像研究的重要工具。

  2. 钙信号分区特性：揭示了人类小胶质细胞中钙信号的显著分区特性和不同形态间的钙信号差异，有助于理解小胶质细胞在不同环境中的功能响应。

  3. 组织样本与培养技术：利用新鲜术后人类皮层组织，结合人类脑脊液进行有机型培养，成功保留了小胶质细胞的三种主要形态，提供了重要的体外研究模型。

研究的局限性

尽管该研究在分析人类小胶质细胞钙信号方面取得了重要进展，但也存在一定局限性。由于组织样本来源于癫痫或肿瘤手术，不能完全代表正常健康组织。此外，表达遗传编码钙指示剂需要进行有机型切片培养，这可能改变细胞的功能特性。

这项研究在技术和方法上取得了重要突破，为未来人类小胶质细胞的功能研究提供了宝贵的数据和方法支持。