EGCG 通过ROS/Txnip/NLRP3 途径介导抑制BV2细胞中LPS/AβO 引发的神经炎症

2024-08-02 Fri
阿尔茨海默症 β-淀粉样蛋白表没食子儿茶素没食子酸酯 NLRP3 炎性小体 Txnip
Epigallocatechin-3-Gallate（EGCG）通过调节ROS/TXNIP/NLRP3通路抑制BV2细胞中的神经炎症研究背景阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease, AD）是一种主要发生在老年人中的退行性脑病，特征为持续的认知功能障碍和行为损害。AD的神经病理学变化包括β-淀粉样蛋白（Aβ）的沉积、异常神经原纤维缠结（Neurofibrillary Tangles, NFTs）以及大脑中的神经元丧失。研究表明，Aβ的慢性沉积会激活小胶质细胞，导致慢性炎症并最终导致神经元死亡和认知功能障碍。此外，核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族吡啶结构域3（NLRP3）炎性小体的激活与小胶质细胞炎症和AD密切相关。因此，预防炎症小体的激活可能是治疗AD的潜在干预措施。
研究动机当前研究表明，许多NLRP3炎性小体刺激物可以诱导活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）的产生，并且ROS的增长对于炎性小体的激活至关重要（Dominic et al. 2022）。ROS被视为触发NLRP3炎性小体形成和激活的关键因素（Billingham et al. 2022），而ROS水平升高的主要原因是线粒体功能障碍（Angelova和Abramov 2018）。TXNIP（硫氧还蛋白相互作用蛋白）是ROS清除蛋白硫氧还蛋白（Trx）的内源性抑制剂，是在氧化应激和NLRP3炎炎小体之间的桥梁。在这种背景下，本研究聚焦于绿茶中的多酚物质表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（Epigallocatechin-3-Gallate, EGCG）的抗炎机制。
研究来源该研究由以下作者进行：Yanyan Xiao, Chenglin Yang, Nana Si, Tao Chu, Jiahui Yu, Xintong Yuan和Xiang-Tao Chen，他们都来自安徽医科大学药学院。该论文发表于《Journal of Neuroimmune Pharmacology》，正式接受日期为2024年6月8日，网址为https://doi.org/10.1007/s11481-024-10131-z。
研究流程科学实验部分为了验证EGCG对BV2细胞炎症的抑制作用，实验采用了以下步骤：
细胞培养及处理：
BV2细胞（北京，中国）培养于未完全的高葡萄糖DMEM培养基中，添加10％胎牛血清（FBS）和1％的青霉素-链霉素，在37℃、5％CO2孵箱中培养。
炎症诱导与药物处理：
实验步骤包括：
将BV2细胞分别暴露于EGCG（5 µM、10 µM和20 µM）溶液或MCC950（10 µM）、NAC（20 mM）或Mitoquinone（MitoQ, 0.2 µM）中1小时。
随后用LPS（1 µg/ml）处理1小时，再用Aβ1-42寡聚体（Aβo）（10 µg/ml）处理6小时，以诱导炎症反应（Zhong et al. 2019）。
细胞活性检测：
使用CCK-8试剂盒测定BV2细胞的存活率，并通过显微镜在450nm波长测量吸光度值。
Western Blot分析与RT-PCR：
分析BV2细胞的蛋白水平（如IL-1β, TNF-α, IBA-1, NLRP3 and Caspase-1），并通过实验确定细胞间炎症指标的变化。
免疫荧光检测与细胞内ROS检测：
通过荧光显微镜观察BV2细胞的ROS生产，并用DCFH-DA染色法检测细胞内的ROS水平。
线粒体膜电位检测：
通过JC-1荧光探针检测BV2细胞的线粒体膜电位变化，分析细胞在线粒体损伤下ROS的产生情况。
研究结果ECCG对LPS/Aβo诱导的BV2细胞中的炎症反应的抑制作用EGCG处理后，BV2细胞的相关炎性因子如IL-1β, IL-6, TNF-α的mRNA表达水平显著降低（图1a-c），对应蛋白水平的表达也显著减少（图1d-i）。通过免疫荧光染色进一步证实EGCG还减少了炎性反应的引发和Aβ沉积（图1j）。
EGCG对LPS/Aβo诱导的炎症反应通过抑制NLRP3炎性小体的激活在探讨EGCG对BV2细胞中炎症抑制的机制时，发现EGCG降低了NLRP3, ASC, Caspase-1等炎性小体相关分子的表达水平（图2a-e）。特别是IL-1β的表达在EGCG处理后显著降低，这证实了其对炎性小体激活的抑制作用。此外，通过使用炎性小体抑制剂MCC950和激活剂ATP，验证了EGCG对NLRP3炎性小体的抑制机制（图2f-h）。
EGCG通过减少氧化应激抑制LPS/Aβo诱导的BV2细胞中NLRP3炎性小体的活化内源性ROS产量的增加是NLRP3炎性小体活化的重要因素。本研究通过荧光探针染色法发现，EGCG显著减少了LPS/Aβo诱导的细胞内ROS水平，并通过ROS抑制剂NAC和ROS激活剂tBHP验证了效果（图3a-b）。
EGCG由于线粒体功能障碍导致ROS的抑制实验进一步探讨了EGCG是否通过线粒体功能障碍抑制ROS的生成。结果显示，EGCG和线粒体特异性ROS抑制剂MitoQ表现出了类似的效果（图4a）。通过JC-1荧光探针，发现EGCG和MitoQ都能减少线粒体损伤诱导的绿色荧光比例（图4b-f）。
TXNIP在EGCG调节NLRP3炎性小体激活中的作用作为关键信号分子，TXNIP在氧化应激和NLRP3炎性小体激活中扮演关键角色。本研究发现EGCG能抑制LPS/Aβo诱导的BV2细胞中TXNIP的表达，并通过siRNA敲低和过表达实验进一步确认了EGCG的抑制效果（图5a-i）。
结论及意义该研究证明了EGCG具有通过ROS/TXNIP/NLRP3通路抑制神经炎症的潜在机制，为AD的治疗提供了新的思路。虽然本研究的药理机制是在体外模型中验证的，但其在体内模型中的药物代谢动力学和与其他分子的相互作用仍需进一步研究。通过强调EGCG抑制炎性小体活化的新机制，此研究为AD防治提供了新的潜在靶点，并揭示了抗炎症治疗的新路径。
研究亮点首次揭示了EGCG通过线粒体ROS/TXNIP/NLRP3通路抑制神经炎症的机制。
EGCG显示出显著的抗炎症和神经保护作用，为AD的治疗提供了潜在的新方法。
提供了一种可能的靶向治疗途径，对后续研究具有重要指导意义。
研究的局限性及未来方向虽然EGCG在体外研究中已显示出良好的抗炎效果，但其在体内模型中的药效仍需进一步验证，特别是其在脑内的生物利用度和具体信号机制。此外，EGCG与其他抗炎或神经保护药物的联合应用潜力也值得探讨。