rh-relaxin-2はERK-nNOS-NO経路を介してラットの脳室出血後の酸化ストレスと神経細胞アポトーシスを軽減する

学術的背景

脳室出血（Germinal Matrix Hemorrhage, GMH）は、新生児において最も一般的な神経系疾患の一つであり、特に早産児において脳損傷の主要な原因となっています。GMHは急性炎症反応を引き起こすだけでなく、酸化ストレスと神経細胞アポトーシスを引き起こし、長期的な神経機能障害を引き起こします。酸化ストレスと神経細胞アポトーシスは、GMHの後遺症を引き起こす重要な要因と考えられています。そのため、GMH後の脳損傷を軽減するための効果的な抗酸化および抗アポトーシス戦略を見つけることが重要です。

Relaxin-2は、インスリン様ペプチドファミリーの一員であり、Relaxinファミリーペプチド受容体1（RXFP1）と結合してその生物学的機能を発揮します。これまでの研究では、Relaxin-2が虚血再灌流損傷において抗酸化および抗アポトーシス作用を持つことが示されていますが、GMHにおけるその役割はまだ明確ではありませんでした。そこで、本研究では、Relaxin-2がERK-nNOS-NO経路を介してGMH後の酸化ストレスと神経細胞アポトーシスを軽減するかどうかを探ることを目的としました。

論文の出典

この研究は、南方医科大学南方医院神経外科のJun Liu、Yonghua Cai、Khalil Ur Rahman、Qixiong Zhouらによって共同で行われ、Guozhong Zhang、Ye Song、Peng Liが連絡著者として参加しました。論文は2025年に『Fluids and Barriers of the CNS』誌に掲載され、DOIは10.1186/s12987-024-00616-7です。

研究の流れと結果

1. 研究デザインと実験の流れ

本研究では、7つの実験が設計され、以下のステップで進められました。

実験1：内因性Relaxin-2とRXFP1の発現と相互作用

• 研究対象：36匹のラットをGMH後0、0.5、1、3、5、7日に分けて脳組織サンプルを採取。
• 実験方法：Western blotを用いてRelaxin-2とRXFP1の発現変化を検出。免疫蛍光二重染色と共免疫沈降（Co-IP）により、Relaxin-2とRXFP1の共局在と相互作用を分析。
• 結果：GMH後12時間で内因性Relaxin-2の発現が減少し、RXFP1の発現が12時間後に上昇し、1日目にピークに達した後、徐々に減少しました。免疫蛍光とCo-IPにより、Relaxin-2とRXFP1が神経細胞内で共局在し、相互作用することが確認されました。

実験2：rh-relaxin-2が酸化ストレスと神経細胞アポトーシスに及ぼす影響

• 研究対象：18匹のラットを偽手術群、GMH+Vehicle群、GMH+rh-relaxin-2群に分ける。
• 実験方法：Western blotを用いてアポトーシスマーカーBcl-2、Baxおよび酸化ストレスマーカーRomo1の発現を検出。NO定量測定。
• 結果：rh-relaxin-2はBcl-2とNOを有意に上昇させ、BaxとRomo1を低下させ、抗酸化および抗アポトーシス作用を持つことが示されました。

実験3：TUNEL染色とDHE染色による神経細胞アポトーシスと酸化ストレスの評価

• 研究対象：36匹のラットを偽手術群、GMH+Vehicle群、GMH+rh-relaxin-2群に分ける。
• 実験方法：TUNEL染色により神経細胞アポトーシスを検出し、DHE染色により酸化ストレスレベルを測定。
• 結果：rh-relaxin-2はTUNEL陽性神経細胞とDHE蛍光強度を有意に減少させ、抗アポトーシスおよび抗酸化作用をさらに確認しました。

実験4：rh-relaxin-2の作用におけるRXFP1のメカニズム

• 研究対象：30匹のラットを偽手術群、GMH+Vehicle群、GMH+rh-relaxin-2群、GMH+sgCtrl+rh-relaxin-2群、GMH+sgRXFP1+rh-relaxin-2群に分ける。
• 実験方法：レンチウイルスを用いてRXFP1をノックダウンし、Western blotで関連タンパク質の発現を検出。
• 結果：RXFP1のノックダウンは、rh-relaxin-2の抗アポトーシスおよび抗酸化作用を有意に抑制し、RXFP1がrh-relaxin-2の作用に重要な受容体であることが示されました。

実験5：rh-relaxin-2の作用におけるERK経路のメカニズム

• 研究対象：30匹のラットを偽手術群、GMH+Vehicle群、GMH+rh-relaxin-2群、GMH+Corn Oil+rh-relaxin-2群、GMH+LY3214996+rh-relaxin-2群に分ける。
• 実験方法：ERK阻害剤LY3214996を用いてERK経路を阻害し、Western blotで関連タンパク質の発現を検出。
• 結果：ERK阻害剤は、rh-relaxin-2の抗アポトーシスおよび抗酸化作用を有意に逆転させ、ERK経路がrh-relaxin-2の作用に重要な役割を果たすことが示されました。

実験6：rh-relaxin-2の副作用評価

• 研究対象：rh-relaxin-2処理群と未処理群の2群のラット。
• 実験方法：行動学テスト（オープンフィールドテストとT迷路）を用いて神経行動を評価し、肝機能（AST、ALT）と腎機能（クレアチニン）を測定。
• 結果：rh-relaxin-2処理群と未処理群の間で、神経行動、体重、肝機能および腎機能に有意な差は見られず、その安全性が確認されました。

実験7：NOレベルの定量測定

• 研究対象：実験2、4、5の脳組織サンプル。
• 実験方法：Griess試薬を用いてNOレベルを測定。
• 結果：rh-relaxin-2はNOレベルを有意に上昇させ、NO経路を介して作用することをさらに支持しました。

2. 主な結果と結論

• 主な結果：

  1. rh-relaxin-2はRXFP1-ERK-nNOS-NO経路を介してGMH後の酸化ストレスと神経細胞アポトーシスを有意に軽減しました。
  2. RXFP1とERK経路は、rh-relaxin-2の作用に重要な役割を果たします。
  3. rh-relaxin-2は、長期的な行動学テストおよび肝機能・腎機能評価において有意な副作用を示しませんでした。

• 結論： 本研究は、rh-relaxin-2がRXFP1-ERK-nNOS-NO経路を介してGMH後の酸化ストレスと神経細胞アポトーシスを軽減することを初めて実証しました。この発見は、GMHの治療における新たな潜在的な戦略を提供し、科学的および応用的な価値が高いものです。

研究のハイライト

1. 革新性：rh-relaxin-2がGMHにおいて抗酸化および抗アポトーシス作用を持つことを初めて明らかにし、その作用機序を明確にしました。
2. 応用価値：rh-relaxin-2は、良好な安全性と有効性を持つ潜在的な治療薬として、臨床応用が期待されます。
3. 方法論的貢献：Western blot、免疫蛍光、TUNEL染色、DHE染色など、多様な実験手法を用いてrh-relaxin-2の作用機序を包括的に検証しました。

まとめ

本研究は、系統的な実験デザインを通じて、rh-relaxin-2がGMHにおける作用機序を詳細に探り、RXFP1-ERK-nNOS-NO経路を介して酸化ストレスと神経細胞アポトーシスを軽減することを実証しました。この発見は、GMHの病理メカニズムに対する理解を深めるだけでなく、新たな治療戦略の開発に重要な理論的基盤を提供します。