深部および広範囲イメージングのための広視野・単一細胞分解能を持つ二光子および三光子顕微鏡

2025-02-14 Fri
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大視野、単細胞分解能の二光子および三光子顕微鏡による深部および広域イメージング研究背景と問題提起多光子顕微技術（Multiphoton Microscopy, MPM）は、特に生体脳機能研究において不可欠な深部組織イメージングのための強力なツールです。しかし、従来の二光子顕微鏡（Two-Photon Microscopy, 2PM）は比較的大きな視野（Field of View, FOV）を実現できますが、そのイメージング深度は通常浅い皮質領域に限定され、脳の深部構造には到達できません。一方、三光子顕微鏡（Three-Photon Microscopy, 3PM）はより深いイメージングが可能ですが、熱損傷によりレーザーの繰り返し周波数が制限され、視野が小さく、イメージングスループットが低いという課題があります。そのため、高解像度を維持しつつ大視野（Large Field of View, LFOV）と深部イメージングを実現する方法が、多光子顕微技術分野における緊急の課題となっています。
この問題を解決するために、Aaron T. MokらはDeepScopeと呼ばれる新しい多光子顕微システムを開発しました。このシステムは、蛍光信号生成効率を最適化する一連の革新技術を通じて、大視野かつ単細胞分解能での深部イメージングを実現しました。本研究は、従来の多光子顕微鏡の技術的限界を突破し、神経回路のシステムレベルの研究に新たなツールを提供することを目指しています。
論文の出典と著者情報この論文は、Aaron T. Mok、Tianyu Wang、Chris Xuら研究者によって執筆されました。第一著者のAaron T. Mokと責任著者のChris Xuは、アメリカのコーネル大学応用物理学・工学物理学科（School of Applied and Engineering Physics, Cornell University）に所属しています。他の著者はボストン大学、ハーバード大学、マサチューセッツ工科大学などの著名な機関から参加しています。論文は2024年にオープンアクセスジャーナル『eLight』に掲載され、タイトルは「A large field-of-view, single-cell-resolution two- and three-photon microscope for deep and wide imaging」です。
研究方法と実験設計a) 研究プロセスと実験の詳細1. DeepScopeシステムの開発DeepScopeは、双励起アダプティブポリゴン走査型多光子顕微鏡（Dual Excitation with Adaptive Excitation Polygon-Scanning Multiphoton Microscope）であり、主な革新点は以下の通りです：
- 適応励起（Adaptive Excitation）：電気光学変調器（Electro-Optic Modulators, EOMs）を使用してレーザーパワーを動的に調整し、血管の影の領域でパワーを低減することで、興味対象領域の有効パワーを向上させます。
- ビームレット走査方式（Beamlet Scanning Scheme）：ビームレット遅延ラインを使用して単一のレーザーパルスを約20ナノ秒の時間差を持つ2つのビームレットに分割し、これによりレーザーの繰り返し周波数と走査速度を効果的に向上させます。
- ポリゴンスキャナー（Polygon Scanner）：大口径（9.5ミリメートル）のポリゴンスキャナーを採用し、最大6キロヘルツのライン走査速度を実現し、従来のガルバノスキャナーを大幅に上回ります。
2. 実験対象とサンプル処理研究では主にトランスジェニックマウス（Transgenic Mice）と成体ゼブラフィッシュ（Adult Zebrafish）を実験対象としました。実験中、研究者たちはマウスに対して慢性頭蓋窓手術を行い、GCaMP6sカルシウム指示薬でニューロンを標識しました。ゼブラフィッシュに関しては、麻酔と固定後に全脳イメージングを行いました。
3. 実験ステップとテスト内容マウス脳深部イメージング：DeepScopeシステムを使用して、マウスの大脳皮質第6層（Layer 6, L6）および海馬CA1領域（Cornu Ammonis 1, CA1）の構造と機能イメージングを行い、システムの深部イメージング能力を検証しました。
同時二光子および三光子イメージング：同一視野内で浅層および深層皮質領域に対する二光子および三光子イメージングを行い、システムの多機能性を示しました。
ゼブラフィッシュ全脳イメージング：成体ゼブラフィッシュの全脳構造イメージングを行い、システムの広域イメージング能力をさらに検証しました。
4. データ分析アルゴリズム研究者たちは、MATLABベースの画像処理スクリプトを開発し、二光子および三光子信号を分離するとともに、Suite2Pソフトウェアを使用してカルシウムアクティビティデータのモーション補正、ニューロンのセグメンテーション、蛍光信号の抽出を行いました。
b) 主要結果とデータ分析1. マウス脳深部イメージングDeepScopeは直径3.5ミリメートルの大視野イメージングを成功裏に実現し、マウス脳の最も深い皮質領域をカバーしました。実験データによると、600マイクロメートルの深さで、システムは4ヘルツのフレームレートで917個のニューロンの自発活動を記録できました。また、海馬CA1領域のイメージングを通じて、システムの亜皮質領域におけるイメージング能力も検証されました。
2. 同時二光子および三光子イメージング実験では、DeepScopeが同一視野内で浅層および深層皮質領域のニューラルアクティビティを同時に記録できることが示されました。例えば、320～600マイクロメートルの深さ範囲で、システムは11ヘルツのフレームレートで4523個のニューロンのカルシウムアクティビティを記録しました。
3. ゼブラフィッシュ全脳イメージングDeepScopeはさらに、成体ゼブラフィッシュの全脳構造イメージング能力を示し、イメージング深度は1ミリメートルを超え、視野は3ミリメートル以上でした。実験結果は、端脳、視頂蓋、小脳領域のGCaMP6s標識核および骨構造や繊維束の三次高調波信号（Third Harmonic Generation, THG）を明確に示しました。
c) 研究結論と価値DeepScopeの成功した開発は、多光子顕微技術に新しい解決策を提供し、主な貢献は以下の通りです：
- 科学的価値：大視野かつ単細胞分解能の深部イメージングを実現し、従来の多光子顕微鏡の技術的制約を突破しました。
- 応用価値：神経科学、免疫学、腫瘍学など幅広い分野に応用でき、システムレベルの神経回路研究や疾患モデル解析に重要なツールを提供します。
d) 研究のハイライト技術革新：適応励起とビームレット走査方式により、蛍光信号生成効率が大幅に向上しました。
多機能性：異なる深さの領域の研究ニーズに対応するため、二光子と三光子の同時イメージングをサポートします。
広域イメージング能力：初めて成体ゼブラフィッシュの全脳構造の高解像度イメージングを実現しました。
e) その他の有用な情報DeepScopeの設計はシンプルでコンパクトであり、既存の多光子顕微鏡に容易に統合でき、生物医学研究ラボにとって実用的なソリューションを提供します。
まとめと意義Aaron T. Mokらの研究は、多光子顕微技術における主要な課題を解決するだけでなく、今後の神経科学研究に強力なツールを提供しました。DeepScopeの開発は、多光子顕微技術が新たな段階に入ったことを示しており、その革新性と実用性により、この分野における画期的な成果となっています。