血友病A患者唾液通过外源性十酶复合物触发凝血

医学 血液病学
血友病A 外源性十酶复合物 唾液 凝血 FVII缺乏

人唾液中的外源性凝血酶复合物在重型血友病A患者中的凝血触发作用

背景介绍

血友病A（Hemophilia A）是一种由第VIII凝血因子（FVIII）缺乏或缺陷引起的遗传性出血性疾病，表现为X染色体隐性遗传。重型患者通常面临关节反复出血的困扰，然而，与关节出血相比，口咽部黏膜出血在这些患者中却非常少见。这种现象长期以来缺乏生物学依据的解释。同时，一种罕见的凝血障碍性疾病——FVII缺乏症在患者中表现为较多的口咽部出血。因此，了解这两种出血表现背后的机制对优化临床管理及患者教育至关重要。

最近的研究揭示人体某些体液，例如羊水、母乳和唾液中存在外泌体（Extracellular Vesicles，EVs），这些EVs携带组织因子（Tissue Factor，TF）与活化的第VII因子（FVIIa）共同形成外源性凝血酶复合物（Extrinsic Tenase Complex），能够启动凝血过程。本篇论文的研究者提出了这样的假设：唾液中的外源性凝血酶复合物可能对重型血友病A患者减少口咽部出血风险具有一定的保护作用，而对FVII缺乏的患者，因唾液中缺乏功能性外源性凝血酶复合物，可能解释其口咽部出血的多发性。

来源与作者信息

本研究由Johannes Thaler及其团队主导，研究机构包括奥地利维也纳医科大学、荷兰阿姆斯特丹大学医学中心和德国美因茨大学附属医院等国际权威机构。该论文发表于2024年12月19日的《Blood》期刊，其资助来源包括德国研究基金会与维也纳市长医学科学基金。

研究方法与流程

研究设计与试验流程

研究者从以下两类人群中收集了血液与唾液样本： 1. 重型血友病A患者：5名男性（FVIII活性 IU/dL）； 2. 重型FVII缺乏症患者：3名男性（FVII活性 IU/dL）。

这些样本在凝血因子替代疗法前后均被收集。研究核心步骤和技术包括：

  1. 唾液与血液样本处理：

    • 使用差速离心法去除细胞，获得无细胞唾液；
    • 利用高效离心和尺寸排阻色谱分离外泌体（即EV）与非外泌体组分。

  2. 凝血功能实验：

    • 全血与血浆凝血实验：将唾液添加到自身FVIII缺乏的全血或血浆中，观测凝血时间及纤维蛋白生成；
    • 凝血酶（Thrombin）生成实验：检测唾液是否触发凝血酶生成；
    • 活化因子Xa（FXa）生成实验：通过分光光度计测定唾液是否直接活化因子X生成FXa。

  3. 外泌体特征鉴定：

    • 透射电镜（TEM）观察EV形态；
    • 流式细胞术和Western Blot检测EV标志物（如CD63、CD9）；
    • 抗体抑制实验探讨EV中TF/FVIIa复合物的活性。

  4. 临床出血模式分析：

    • 对不接受常规FVIII预防治疗的6名血友病A患者过去12个月的出血事件进行回顾性调查。

数据分析与统计

使用GraphPad Prism进行配对t检验，对连续变量以均值±标准差表示，显著性水平设定为P<0.05。

核心研究结果

唾液在重型血友病A患者凝血中的作用

  1. 唾液触发FVIII缺乏全血和血浆的凝血：

    • 唾液显著缩短FVIII缺乏全血的凝血时间（1125±139秒降至270±37秒，P=0.0006)；
    • FVIII缺乏血浆在唾液作用下也发生凝血，同时观察到纤维蛋白生成与FXa活性显著提升。

  2. 唾液中外源性凝血酶复合物的证实：

    • 唾液中的EV通过诱导FXa生成显现高度凝血活性。进一步的抗体抑制实验显示，这种活性由TF/FVIIa复合物介导。

  3. 补钙对于复合物稳定性的重要性：

    • 唾液中TF/FVIIa复合物在去除钙离子后解离，显示钙离子稳定了TF/FVIIa的复合结构。

  4. 患者出血模式调查：

    • 在6名未接受常规FVIII预防治疗的患者中，总计105次出血中，口咽部出血仅占19次（18%），均为轻微创伤后发生且能够自发止血。与此相对的是，关节和肌肉出血占主导（66%和14%），且均需FVIII治疗。

FVII缺乏患者的唾液观察

与血友病A患者不同，FVII缺乏患者的唾液未显示外源性凝血酶复合物的功能活性。通过添加重组FVIIa后可观察到FXa生成的恢复，表明唾液TF对FVIIa具有高亲和性。

研究结论与价值

该研究首次揭示了重型血友病A患者唾液中的EV可通过外源性凝血酶复合物触发凝血，从而解释了这部分患者口咽部出血罕见的现象。这一机制的发现对以下方面具有重要意义：

  1. 科学价值：

    • 提供了血友病A与FVII缺乏症在出血表型差异的分子基础；
    • 提出唾液TF与FVIIa之间可能存在高亲和性结合。

  2. 临床意义：

    • 对患者教育具有潜在应用价值，例如向血友病A患者解释其口咽部创伤后可能存在一定自限性。
    • 可为进一步优化出血管理策略提供依据，为异质患者群体的个性化治疗铺路。

  3. 未来扩展可能性：

    • 类似机制可能存在于其他包含EV的生理液体中，如母乳、尿液与精液。

研究亮点与方法学创新

  1. 本研究首次将人体唾液的凝血潜力与血友病A出血表型联系，填补了该领域的空白。
  2. 采用多种经典与创新实验方法（如凝血酶生成实验、高效EV分离等），确保了研究数据的可靠性与可重复性。

该研究深化了对唾液中EVs的凝血功能的理解，在揭示血友病A及FVII缺乏不同出血表型的机制方面迈出了重要一步，为相关疾病的未来研究与管理提供了宝贵线索。