由DNA或RNA靶标结合激活的Cas9转核酸酶活性

在本研究中，我们证明了另一类2型CRISPR-Cas系统——II型Cas9系统，也具备“trans-cleavage”活性，该活性由crRNA和tracrRNA指导并通过DNA或RNA目标的结合而激活。通过将Cas9效应核酸酶的trans-cleavage活性与核酸扩增技术结合，我们创建了名为DACD和RACD的特异性DNA和RNA样本检测平台。

Cas9在chimeric sgRNA和nonchimeric crRNA与tracrRNA的指导下，显示出显著不同的ssDNA trans-cleavage活性。酶动力学分析表明，在crRNA和tracrRNA指导下的Cas9 trans-cleavage的催化效率远高于chimeric sgRNA指导下的Cas9 trans-cleavage。这一差异可能与SpyCas9-sgRNA-target DNA和SpyCas9-crRNA-tracrRNA-target DNA复合物不同的结构组成有关。我们观察到，与SpyCas9-sgRNA-target DNA复合物相比，SpyCas9-crRNA-tracrRNA-target DNA复合物具有更为均一的结构组装。此外，我们还注意到两种复合物中HNH结构域的显著差异，尽管其他结构域的构象几乎相同。

与Cas12a相似，Cas9也显示出对trans-substrate切割的底物序列偏好。Cas9和Cas12a核酸内切酶均更倾向于降解富含T或C的ssDNA底物，这表明这可能是II型和V型CRISPR效应蛋白共有的性质。我们验证了Cas9介导的trans-cleavage和cis-cleavage的底物序列偏好。虽然HNH结构域依赖的cis-cleavage对互补链可能没有序列偏好，但Ruvc结构域依赖的cis-cleavage对非互补链则有序列偏好，与非特异性ssDNA的trans-degradation一致。这些结果暗示，Ruvc结构域依赖的cis-cleavage和trans-cleavage可能具有相似的切割机制。

Cas9、Cas12a和Cas13a在trans-cleavage活性方面的细致比较表明，虽然它们显示出不同的底物结合亲和力和不同的底物催化效率，但它们在检测DNA和RNA靶标寡核苷酸的放大自由检测的极限中具有类似的检测限。与基于Cas12-和Cas13a的平台相比，Cas9基于检测平台可能具有一些优势。

整体而言，我们的研究为Cas9介导的核酸检测提供了新的见解，同时也为Cas9在基因编辑中的应用提供了新的考量。尽管我们的研究只证实了Cas9在体外具有trans-cleavage活性，但我们不能排除其在体内也可能发生影响基因编辑的可能性，因此还需要进一步的研究来确定当使用CRISPR-Cas9时，这种活性是否影响其他物种的基因编辑。