CD28共刺激作用通过LCK/CD3ζ/ZAP70信号轴增强CAR-NK细胞的功能

研究背景与目的

嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor, CAR）T细胞治疗在治疗某些晚期癌症患者中表现出显著效果。然而，CAR-T细胞疗法存在着诸多限制，例如高成本、制备过程繁琐及细胞因子释放综合征和神经毒性等。因此，研究人员转向探讨替代方法，其中自然杀伤（Natural Killer, NK）细胞作为癌症免疫治疗的热门候选者，因为其可作为现成的细胞免疫疗法且不会引起移植物抗宿主病（Graft-Versus-Host Disease, GVHD）。

在本研究中，科研人员研究了在针对CD70的CAR构建中，采用不同的共刺激分子对NK细胞抗瘤活性的影响，试图找出最有效的共刺激信号域并评估其在多种异种移植模型中的抗瘤效果。

论文来源

本论文的主要作者包括Sunil Acharya、Rafet Basar等人，皆来自于德克萨斯大学MD Anderson癌症中心、休斯顿大学等科研机构。该研究于《Cancer Discovery》期刊上发表。

研究流程与方法

研究流程概述

研究团队构建了多个针对CD70的CAR体系，这些体系分别整合了与NK细胞相关的共刺激信号域（DAP10和DAP12）、与T细胞相关的共刺激信号域（CD28）以及双重共刺激信号域（4-1BB）。研究主要分为以下几步：a) 制备和体外筛选不同CAR结构的NK细胞；b) 分析这些NK细胞在体内外的抗瘤活性；c) 进行详细的信号机制研究，探索CD28共刺激作用是否通过传统的T细胞受体（TCR）信号通路来增强CAR-NK细胞的功能。

细胞的制备与CAR构建（生成和体外筛选）

研究者首先深入分析了多种实体肿瘤和血液系统恶性肿瘤中CD70的表达情况，通过组织微阵列免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）技术和流式细胞术，证实了CD70在多种癌症中具有过度表达的特点，而在正常组织中表达较低，验证了CD70作为CAR靶点的潜力。

接下来，研究团队设计了多种以CD27为基础的CAR构建，将其与NK细胞相关的DAP10/DAP12、T细胞相关的CD28及4-1BB共刺激信号域连接。通过转导手段将这些CAR基因转入脐带血来源的NK细胞中并进行体外筛选。实验显示CAR-NK细胞转导效率相似，且它们在体外的增殖和细胞因子的分泌没有显著差异。各组CAR-NK细胞对各种癌细胞系表现出不同程度的细胞毒性，以此评估其效应功能。

长期和重复刺激实验与多功能性分析

研究者通过长时间的体外反复肿瘤再挑战实验，模拟肿瘤患者体内的复杂环境。结果表明，具有CD28共刺激信号域的CAR-NK细胞（CAR27-28ζ）在面对CD70阳性肿瘤细胞时展现出更强的长期细胞毒性。此外，使用IsoPlexis平台对单细胞多功能性进行分析，结果显示CAR27-28ζ NK细胞在基础状态和被CAR刺激后均展现出高度的多功能性，主要分泌效应型和趋化型细胞因子。

通过时间飞行质谱细胞计数（CYTOF）技术，研究发现具有CD28共刺激信号域的CAR-NK细胞在多次肿瘤细胞再挑战后，仍然保持高水平的胞杀能力，显示出稳定的执行性细胞因子的高表达，如穿孔素和颗粒酶B。

动物模型中的体内实验

在四种肿瘤模型（两种血液系统肿瘤模型和两种实体瘤模型）中，CAR27-28ζ NK细胞均表现出显著的抗肿瘤活性和增强的存活率。尤其在高度侵袭性的CD70+ Raji Burkitt淋巴瘤小鼠模型中，CAR27-28ζ NK细胞显现出最佳的抗肿瘤效果。

CD28共刺激信号的机制研究

为了探讨CD28共刺激信号在NK细胞中的下游信号途径，研究人员发现，在CD28的PYAP结构域被删除，或者ITAM酪氨酸残基被突变后，NK细胞中CD3ζ的磷酸化水平显著降低。这表明LCK与CD28共刺激结构域的结合在信号传导中至关重要。

通过一系列的免疫共沉淀实验，研究者证实了ZAP70与含有CD28的CAR结构中CD3ζ的结合显著增强。进一步验证了ZAP70与CD3ζ通过LCK的参与形成一个完整的信号传导路径。

研究结论与意义

研究发现，通过整合CD28共刺激信号域，可显著增强CD70靶向的CAR-NK细胞的抗肿瘤活性。详细的信号机制研究证实了CD28通过招募LCK并促进CD3ζ磷酸化，从而增强了下游信号传导和NK细胞的效应功能。

此研究不仅在学术上提供了新的见解，也为临床上CAR-NK细胞在癌症免疫治疗中的应用提供了理论基础。目前，基于该研究成果的临床I/II期试验已在进行中，旨在评估CD28共刺激域的CAR-NK细胞在CD70阳性血液系统恶性肿瘤和实体肿瘤患者中的安全性和疗效。

研究亮点

1. 靶点选择：研究验证了CD70作为多个癌症类型的“泛癌抗原”的潜力，具有广泛的临床应用前景。
2. 共刺激信号域：首次系统评估了多种共刺激信号域对CAR-NK细胞作用的影响，发现CD28共刺激域在增强NK细胞效应功能方面独具优势。
3. 信号机制：详细解析了CD28信号在CAR-NK细胞中的作用机制，揭示了LCK/CD3ζ/ZAP70信号轴在细胞激活和抗肿瘤功能中的关键作用。

本研究为推进CAR-NK细胞的临床应用提供了重要的理论支持和实验基础，在癌症免疫治疗领域具有重要意义。