体细胞和生殖细胞PRNP变异在散发性人类朊病毒病中的神经病理学定向分析

引言

朊病毒病（Prion diseases）是一类传染性、进行性、致命的神经退行性疾病，以朊蛋白（PrP）路径性折叠和聚集为特征。朊蛋白由PRNP基因编码，正常细胞内的朊蛋白（PrPc）是疾病特异性构象（PrPSc）的底物，朊病毒在不同哺乳动物间易于传播，例如羊和山羊患的“绵羊痒病”、鹿和麋鹿患的慢性消耗病、牛患的疯牛病以及人类的库鲁病（Kuru）。尽管朊病毒病以其传染性著称，仍有其他病因对疾病负担产生重要影响。

在每百万人的占有率为1–2人，包括感染性、家族性以及散发性起源。其中，感染性病例（包括库鲁病、医源性感染以及人畜共患疯牛病）占比少于1%。大部分病例（约85%）为散发性朊病毒病（sCJD），而家族性朊病毒病占比约15%。这些病病例表现出病因的三种模式：感染性病例在30岁左右出现高峰，遗传性病例约在50岁，散发性病例则多在60岁以上。尽管家族性病例提供了某种启示，散发性朊病毒病的起因仍不详。

家族性朊病毒病因携带PRNP基因的常染色体显性突变（获得性功能突变）所导致。三种完全外显性错义变异勘界特定的临床病理综合征: P102L引起Gerstmann-Sträussler-Scheinker 综合症 (GSS)，D178N导致致命家族性失眠症（FFI）和家族性CJD（fCJD），E200K则也引起fCJD。另有其他变异如V210I和V180I会增加患病风险。阻遏的变异生产早终止密码子，有时位于朊蛋白的N端，因此截断大部分蛋白，可给予保护作用。

既然PRNP生殖系突变可导致早发疾病，我们假设，晚发的散发性朊病毒病可能由体细胞突变引发，这些体细胞突变在个人发育和老化期间产生，因而存在于个体的部分细胞中。尽管体细胞突变为肿瘤的驱动因素，它们也会在非肿瘤组织中积累，包括在老化及神经退行性病变中的神经元中积累。在某些病情环境下，体细胞变异引发的疾病比生殖系变异更为晚发或局部分布，类似于这种机理的表述有Li-Fraumeni综合症中的TP53突变，或者大脑中更分布广泛的mTOR路径变异。虽然早期研究未能证明在阿尔茨海默病（AD）和朊病毒病中广泛存在病视突变，但Heidenhain变种散发性CJD（h-sCJD）示局部表现，提供了研究体细胞镶嵌在局部神经退行性病变中的机会。

研究来源

本文由Gannon A. McDonough等多位学者撰写，涉及多家机构的合作，包括Brigham and Women’s Hospital、Boston Children’s Hospital、Case Western Reserve University School of Medicine、Howard Hughes Medical Institute等。论文发表于2024年7月接受刊登在“Acta Neuropathologica”期刊。

研究流程

研究采用深度DNA测序技术对205例确诊的散发性CJD病例和170例年龄匹配的非疾病对照进行PRNP基因测序。研究特别包含了5例Heidenhain变种散发性CJD（h-sCJD）病例，这些病例在视觉症状和神经病理学上暗示朊蛋白的局部形成。研究团队使用了多重独立引物PCR测序（MIPP-seq）技术，其覆盖深度中值超过5000倍，并使用MosaicHunter进行变异分析。通过对大批量DNA的等位基因混合实验，证明了变异等位基因分数最低可检测至0.2%。

样本和方法

研究使用了两个相互独立的样本群，包括散发性CJD患者和无任何神经疾病诊断的对照人群。205例散发性CJD样本由国家朊病毒病病理监测中心收集并确认，其年龄分布在45至86岁之间，包含95名女性和110名男性。所有CJD样本的确诊基于组织病理学、免疫组化和普朗白蛋白（PrPSc）的蛋白印迹分析。常规PRNP致病突变的家族性朊病毒病病例被排除，确保所有样本为散发性CJD。

对照组共有170名个体，其年龄分布与散发组相匹配，年龄在35至89岁之间，包含55名女性和115名男性，所有对照样本均由NIH Neurobiobank收集。

对于所有样本，包括CJD患者和非疾病对照组，优先选择小脑皮层样本进行分析。此外，对于h-sCJD病例也加入了三种视皮层区域（BA 17、18和19）、前额皮层（BA 46）、顶叶皮层、颞叶皮层、丘脑和齿状核的取样。

体细胞变异检测

采用MIPP-seq技术对PRNP基因进行多重独立引物PCR测序，生成覆盖目标区域的多重扩增子，接着进行双重索引PCR步骤以生成带有样本特异性条形码的扩增子库。我们使用MosaicHunter进行了体细胞变异和生殖系变异的检测和确认，并使用了超高深度测序数据（>5000X）来识别和确认低频变异等位基因。通过稀释实验，检测到的最低等位基因分数为0.2%。

主要结果

研究结果表明，尽管在研究对象中检测到多个多态的生殖系变异，但未在sCJD病例的PRNP基因中识别出真正的体细胞变异。特别是，h-sCJD病例的多处脑区（包含受影响的枕叶皮层）和对照组中也未检测到体细胞变异。这表明，散发性CJD中的风险并未显现为已知的致病生殖系变异（如P102L、D178N和E200K）的体细胞突变。

结论及意义

通过高覆盖率的PRNP基因测序分析，该研究未能证明PRNP基因的体细胞突变在散发性朊病毒病（特别是h-sCJD）中起到主要作用。研究结果挑战了此前体细胞变异是sCJD致病关键机制的假设，提示sCJD或许是由于朊蛋白的自然错误折叠所致，而非特定的体细胞突变引起的。然而，由于朊蛋白少量错误折叠可传播于整个大脑，单一突变细胞可能足以触发疾病，这使得识别体细胞变异的工作非常复杂且艰难。

研究提供了对散发性朊病毒病的新见解：体细胞变异在这种神经变性病中的作用可能被高估，并指示未来研究应着重于探究朊蛋白自然误折叠等其他可能的发病机制。此外，这一发现对公共卫生具有启示意义，可能会影响对具有致病突变患者进行靶向治疗方案的研发，例如降解朊蛋白的技术。