La coloration KMnO₄/Pb sans uranium permet l’imagerie des architectures tissulaires en microscopie électronique à balayage sous vide faible

Contexte académique

La microscopie électronique (Electron Microscopy, EM) est l’un des outils les plus puissants pour étudier les ultrastructures cellulaires et tissulaires. Cependant, les méthodes traditionnelles de coloration métallique des échantillons biologiques nécessitent généralement l’utilisation de composés d’uranium nocifs, ce qui limite l’application généralisée de la microscopie électronique. Ces dernières années, avec le développement de la microscopie à fluorescence à super-résolution, de nombreux biologistes cellulaires se sont tournés vers les techniques d’immunocytochimie, mais le marquage fluorescent reste la base de ces techniques. Par conséquent, l’observation par microscopie électronique reste une méthode indispensable, et son application en biologie continue de s’étendre avec l’évolution des dispositifs et des méthodes.

La microscopie électronique à balayage sous vide faible (Low-Vacuum Scanning Electron Microscopy, LVSEM) permet l’imagerie à haute résolution d’échantillons non conducteurs, car elle peut neutraliser les charges négatives accumulées sur les matériaux non conducteurs grâce aux ions positifs dans les molécules de gaz résiduelles. Cependant, les méthodes traditionnelles de coloration métallique nécessitent l’utilisation de composés d’uranium, qui sont non seulement nocifs pour les opérateurs, mais limitent également l’application généralisée de la LVSEM. Par conséquent, le développement d’une méthode de coloration métallique sûre, rapide et sans uranium est devenu un objectif de recherche important.

Source de l’article

Cet article a été co-écrit par Akira Sawaguchi, Takeshi Kamimura, Kyoko Kitagawa, Yoko Nagashima et Nobuyasu Takahashi, respectivement du Département de biologie cellulaire ultrastructurale de la Faculté de médecine de l’Université de Miyazaki, au Japon, et de Hitachi High-Tech Corporation. L’article a été publié en 2024 dans la revue npj Imaging, sous le titre KMnO₄/Pb staining allows uranium-free imaging of tissue architectures in low vacuum scanning electron microscopy.

Processus de recherche

1. Préparation des échantillons

L’étude a utilisé des rats Wistar mâles âgés de 10 semaines, fixés par perfusion du ventricule gauche avec du formol à 10 % (4 % de paraformaldéhyde) ou un mélange de 2 % de paraformaldéhyde et 2,5 % de glutaraldéhyde. Ensuite, les reins, les poumons, la trachée et les oreilles ont été prélevés, fixés pendant 2 heures supplémentaires, puis déshydratés et inclus dans de la paraffine à l’aide d’un processeur de tissus automatique. Enfin, des coupes de paraffine de 5 ou 20 microns d’épaisseur ont été préparées.

2. Imagerie corrélative en microscopie optique et LVSEM

Les coupes de paraffine ont été déparaffinées et réhydratées, puis colorées à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) et observées au microscope optique. Après observation, les coupes ont été immergées dans du xylène pendant 18 à 24 heures pour retirer les lamelles, puis soumises à une coloration métallique.

3. Coloration métallique KMnO₄/Pb

Les coupes ont d’abord été traitées avec du permanganate de potassium (KMnO₄) à 0,2 % pendant 5 minutes, puis colorées avec une solution de citrate de plomb de Reynolds (Pb) pendant 3 minutes. L’analyse des histogrammes de niveaux de gris a permis de déterminer la concentration optimale de KMnO₄ et le temps de traitement.

4. Imagerie LVSEM

Les coupes colorées ont été observées au LVSEM (TM4000Plus II de Hitachi High-Tech Corporation) avec des tensions d’accélération de 5, 10, 15 ou 20 kV. Des images en mosaïque de l’ensemble de la coupe ont été obtenues par capture semi-automatique.

Résultats principaux

1. Optimisation de la coloration KMnO₄/Pb

L’analyse des histogrammes de niveaux de gris a permis de déterminer que la concentration optimale de KMnO₄ était de 0,2 % avec un temps de traitement de 5 minutes. Par rapport à la coloration traditionnelle à l’uranium/plomb (Ur/Pb), la coloration KMnO₄/Pb a montré des effets de coloration et un contraste d’image similaires dans les glomérules rénaux, les tubules urinaires, l’épithélium transitionnel de l’uretère et l’épithélium folliculaire de la thyroïde.

2. Analyse élémentaire

L’analyse élémentaire a montré que l’intensité du signal d’électrons rétrodiffusés (Backscattered Electron, BSE) dans les colorations KMnO₄/Pb et Ur/Pb était principalement déterminée par la quantité de dépôt de plomb (Pb). L’oxydation par KMnO₄ a augmenté le dépôt de Pb, améliorant ainsi l’intensité du signal BSE.

3. Comparaison avec d’autres méthodes de coloration sans uranium

Par rapport aux méthodes de coloration sans uranium telles que le platine bleu/plomb (Pt-blue/Pb), l’extrait de thé oolong/plomb (Ote/Pb) et l’acétate de samarium/plomb (Sm/Pb), la coloration KMnO₄/Pb a montré un contraste plus élevé dans la lame élastique interne des artères musculaires et la matrice interterritoriale du cartilage élastique.

4. Imagerie tridimensionnelle

La coloration KMnO₄/Pb appliquée à la LVSEM sur coupes épaisses a permis une imagerie tridimensionnelle réussie des glomérules rénaux, des tubules urinaires et des bronches pulmonaires, révélant des architectures cellulaires/tissulaires complexes.

Conclusion

Cette étude a développé une méthode de coloration métallique KMnO₄/Pb sans uranium, permettant une imagerie multiscalaire de coupes de paraffine en microscopie électronique à balayage sous vide faible. Cette méthode est non seulement sûre et rapide, mais offre également un contraste d’image équivalent à celui de la coloration traditionnelle Ur/Pb, adapté à l’observation ultrastructurale. L’oxydation par KMnO₄ a augmenté le dépôt de Pb, améliorant ainsi l’intensité du signal BSE, en particulier dans les tissus élastiques.

Points forts de la recherche

1. Méthode de coloration sans uranium : La coloration KMnO₄/Pb évite l’utilisation de composés d’uranium nocifs, offrant une nouvelle voie pour l’application généralisée de la microscopie électronique en biomédecine.
2. Imagerie multiscalaire : De l’observation au microscope optique à l’échelle centimétrique à l’imagerie LVSEM à l’échelle nanométrique, une analyse complète des architectures cellulaires/tissulaires complexes a été réalisée.
3. Imagerie tridimensionnelle : La LVSEM sur coupes épaisses combinée à la coloration KMnO₄/Pb a permis de révéler avec succès les structures tridimensionnelles des cellules/tissus.
4. Convivialité : Cette méthode ne nécessite aucun équipement ou technique spécial, ce qui la rend adaptée au diagnostic pathologique de routine et aux études rétrospectives.

Signification et valeur

Cette étude fournit une méthode d’imagerie par microscopie électronique sûre et efficace pour la recherche biomédicale, en particulier dans le diagnostic histopathologique et l’analyse des structures tridimensionnelles. De plus, cette méthode peut être utilisée pour des études rétrospectives, permettant l’analyse ultrastructurale de coupes de paraffine conservées depuis de nombreuses années, ce qui favorise le développement de la recherche biomédicale.

En développant la méthode de coloration KMnO₄/Pb sans uranium, cette étude résout non seulement les problèmes de sécurité des méthodes de coloration traditionnelles, mais ouvre également de nouvelles perspectives pour l’application généralisée de la microscopie électronique dans le domaine biomédical.