Contexte de la recherche et problématique

L’absorption maladive héréditaire de la folate (Hereditary Folate Malabsorption, HFM) est une maladie génétique rare à transmission autosomique récessive, caractérisée par un déficit d’absorption de la folate au niveau de l’intestin et une obstruction du transport de la folate dans le liquide céphalorachidien. Cette maladie est causée par des mutations inactivantes du gène codant pour le transporteur de folate couplé au proton (Proton-Coupled Folate Transporter, PCFT-SLC46A1). Comprendre l’impact de ces mutations sur la structure et la fonction du PCFT est crucial pour élucider les mécanismes pathologiques de l’HFM.

Récemment, grâce à la technique de microscopie électronique cryogénique, une structure en haute résolution du PCFT de source aviaire (Gallus Gallus PCFT, GPCFT) a été obtenue, avec une homologie séquentielle de 58% avec le PCFT humain (Human PCFT, HPCFT). Cela offre une nouvelle opportunité pour étudier les mutations responsables des défauts fonctionnels du HPCFT. Les études précédentes reposaient principalement sur des modèles homologues basés sur des gabarits d’autres protéines SLC, mais ces modèles n’étaient pas suffisamment précis pour analyser en détail les changements structuraux des protéines mutantes. Par conséquent, les chercheurs souhaitent explorer en profondeur l’impact spécifique de ces mutations sur la structure et la fonction du HPCFT, et examiner les mécanismes par lesquels des mutations compensatoires peuvent restaurer la fonction.

Sources de l’article et informations sur les auteurs

Cet article a été écrit par Prithviraj Nandigrami, I. David Goldman et Andras Fiser, respectivement affiliés aux départements de biologie systémique et computationnelle, de biochimie, ainsi qu’à ceux de médecine, oncologie et pharmacologie moléculaire de l’Albert Einstein College of Medicine. L’article a été publié dans le Journal of Biological Chemistry, avec une date de réception le 4 août 2024, une date de révision le 17 janvier 2025, et un DOI de https://doi.org/10.1016/j.jbc.2025.108280.

Méthodologie de la recherche et processus expérimentaux

1. Modélisation homologue et simulations de dynamique moléculaire

1.1 Construction des modèles

Les chercheurs ont utilisé la structure du GPCFT obtenue par microscopie électronique cryogénique (PDB ID: 7BC7 et 7BC6) comme gabarit pour construire des modèles homologues du HPCFT avec le programme Modeller. Le modèle GPCFT inclut deux formes : liée à l’inhibiteur (pemetrexed-bound) et non liée à l’inhibiteur (inhibitor-free), dont la déviation quadratique moyenne (RMSD) entre les atomes est inférieure à 0,5 Å. Tous les modèles ont été optimisés, y compris la supplémentation des atomes manquants, le calottage des terminaisons et la modélisation des ponts disulfure.

1.2 Simulations de dynamique moléculaire

Tous les modèles ont été simulés intégrés dans une billette phospholipidique entourée d’eau. Les conditions de simulation comprenaient : le modèle d’eau TIP3P, une concentration saline de KCl de 0,15 M, des conditions limites périodiques (PBCs), et une approximation de Ewald sur grille (PME) pour traiter les interactions à longue portée. Chaque modèle a été simulé pendant au moins 1,5 microsecondes, générant environ 10 000 clichés représentatifs pour l’analyse ultérieure.

2. Surveillance des caractéristiques structurelles

2.1 Changements de diamètre du pore

Les chercheurs ont utilisé le programme HOLE pour calculer le rayon moyen du pore de chaque variante HPCFT afin d’évaluer les changements de taille du pore. Les résultats montrent que toutes les mutations ponctuelles simples entraînant une perte de fonction du HPCFT (comme F392V, S196L, F392D) augmentent significativement le diamètre du pore (valeurs de p respectives de 0,0001, 0,0025, 0,0007). L’introduction de mutations compensatoires (comme F392V/S196L, F392D/G305L) ramène le diamètre du pore à un niveau proche de celui du type sauvage (valeurs de p respectives de 0,242 et 0,335).

2.2 Dynamique conformationnelle

Pour évaluer l’impact des différentes mutations sur les hélices TM, les chercheurs ont analysé le regroupement conformationnel des TM4 et TM10. Le nombre de clusters conformationnels chez les types sauvages et les doublets mutants fonctionnels (comme F392M, F392V/S196L, F392D/G305L) est faible (3,5-5), tandis que les mutants simples dysfonctionnels présentent une plus grande diversité (3-4 fois plus). De plus, la proportion des conformations dominantes chez les mutants dysfonctionnels est plus faible (29-33%), indiquant une structure moins ordonnée.

2.3 Changements de surface accessible au solvant

Les chercheurs ont également évalué les changements de la surface accessible au solvant (SASA). Les résultats montrent que les mutants simples dysfonctionnels (comme F392V, S196L, F392D) ont une SASA significativement réduite (valeur de p < 0,0001), tandis que l’introduction de mutations compensatoires ou la préservation de la fonction chez les mutants simples (comme F392M) n’altère pas significativement la SASA par rapport au type sauvage (valeurs de p respectives de 0,3242, 0,7364, 0,0063).

2.4 Changements de contenu en structures secondaires

Les chercheurs ont utilisé le programme DSSP pour calculer le contenu en structures secondaires des hélices TM. Les résultats montrent que le contenu en structures hélicoïdales de toutes les hélices TM diminue significativement (10-20%), et ces structures sont restaurées après l’introduction de mutations compensatoires.

2.5 Analyse des contacts de résidus

Les chercheurs ont utilisé le programme InterCAAT pour analyser les contacts à longue portée entre Phe392 et d’autres résidus. Les résultats montrent que les contacts à longue portée diminuent significativement chez les mutants dysfonctionnels (comme F392V, F392D), mais sont restaurés après l’introduction de mutations compensatoires.

3. Analyse d’autres variants mutants

Les chercheurs ont également analysé un autre mutant dysfonctionnel situé dans une région différente, D109A, qui provoque également une augmentation du diamètre du pore (augmentation de 1,0 Å) et une réduction de la surface accessible au solvant, similaire à celle observée chez F392V.

Principaux résultats de la recherche

1. Les mutations entraînant une perte de fonction augmentent le diamètre du pore et instabilisent la structure

L’étude montre que les mutations entraînant une perte de fonction (comme F392V, S196L, F392D) augmentent significativement le diamètre du pore, accompagné d’une instabilité structurelle des hélices TM internes et d’une réduction de la surface accessible au solvant. Ces changements rendent le chemin de transport de la folate instable, entraînant une perte de fonction de transport.

2. Les mutations compensatoires restaurent la fonction

L’introduction de mutations compensatoires (comme F392V/S196L, F392D/G305L) ramène le diamètre du pore à un niveau proche de celui du type sauvage, stabilise les hélices TM internes et améliore la surface accessible au solvant, permettant ainsi de restaurer la fonction de transport.

3. Impact de la mutation D109A

La mutation D109A située dans une région différente provoque également une augmentation du diamètre du pore et une réduction de la surface accessible au solvant, confirmant que ces mutations affectent généralement la structure et la fonction du HPCFT.

Conclusions et implications de la recherche

1. Valeur scientifique

Cette étude révèle les mécanismes spécifiques par lesquels les mutations entraînant une perte de fonction augmentent le diamètre du pore et instabilisent la structure du HPCFT, et découvre comment les mutations compensatoires peuvent restaurer la fonction. Ces découvertes approfondissent notre compréhension de la structure et de la fonction du HPCFT et fournissent une base théorique pour développer des stratégies thérapeutiques ciblées pour l’HFM.

2. Valeur appliquée

Les résultats de cette étude peuvent aider à développer de nouveaux médicaments, en particulier des traitements personnalisés pour les patients atteints d’HFM. De plus, la méthode de simulation de dynamique moléculaire utilisée dans cette étude peut être appliquée à l’étude d’autres protéines transporteuses de la super-famille SLC, offrant de nouvelles perspectives pour comprendre les mécanismes moléculaires des maladies associées.

3. Points forts de la recherche

Découvertes importantes

• Révèle les mécanismes spécifiques par lesquels les mutations entraînant une perte de fonction augmentent le diamètre du pore et instabilisent la structure.
• Découvre comment les mutations compensatoires peuvent restaurer la fonction.

Innovations méthodologiques

• Utilise la structure du GPCFT obtenue par microscopie électronique cryogénique comme gabarit pour construire des modèles homologues de haute qualité du HPCFT.
• Analyse en détail l’impact des mutations sur la structure et la fonction du HPCFT par des simulations de dynamique moléculaire.

Particularités

• L’objet d’étude est une maladie rare (HFM), ce qui revêt une importance clinique importante.
• Combine plusieurs méthodes expérimentales (simulations de dynamique moléculaire, analyse de la surface accessible au solvant, analyse du contenu en structures secondaires, etc.) pour analyser globalement l’impact des mutations sur le HPCFT.

Cette étude offre une nouvelle perspective pour comprendre les mutations entraînant une perte de fonction du HPCFT et leurs mutations compensatoires, possédant une valeur scientifique et appliquée importante.