Activité trans-nucléase de Cas9 activée par liaison cible de ADN ou ARN

Dans cette étude, nous avons démontré qu’une autre catégorie de systèmes CRISPR-Cas de type II, le système Cas9 de type II, possède également une activité de “trans-clivage”. Cette activité est guidée par des crRNA et tracrRNA et est activée par la liaison aux cibles ADN ou ARN. En combinant l’activité de trans-clivage de la nucléase Cas9 avec des techniques d’amplification des acides nucléiques, nous avons créé des plateformes de détection spécifiques pour des échantillons d’ADN et d’ARN nommées DACD et RACD.

Sous la direction des sgRNA chimériques et des crRNA non chimériques associés aux tracrRNA, Cas9 présente une activité de trans-clivage de l’ADN simple brin (ssDNA) significativement différente. Les analyses cinétiques enzymatiques montrent que l’efficacité catalytique du trans-clivage de Cas9 guidé par des crRNA et tracrRNA est bien supérieure à celle du trans-clivage de Cas9 guidé par des sgRNA chimériques. Cette différence pourrait être liée à la composition structurelle différente des complexes SpyCas9-sgRNA-ADN cible et SpyCas9-crRNA-tracrRNA-ADN cible. Nous avons observé que, comparé au complexe SpyCas9-sgRNA-ADN cible, le complexe SpyCas9-crRNA-tracrRNA-ADN cible présente une structure d’assemblage plus homogène. De plus, nous avons noté des différences significatives dans le domaine HNH entre les deux complexes, bien que les conformations des autres domaines soient presque identiques.

À l’instar de Cas12a, Cas9 montre également une préférence pour les séquences des substrats lors du trans-clivage. Les endonucléases Cas9 et Cas12a tendent toutes deux à dégrader les substrats ssDNA riches en T ou en C, ce qui suggère que cela pourrait être une propriété commune aux protéines effectrices des systèmes CRISPR de type II et V. Nous avons validé la préférence de séquence des substrats lors du trans-clivage et cis-clivage médié par Cas9. Bien que le cis-clivage dépendant du domaine HNH puisse ne pas montrer de préférence de séquence pour la chaîne complémentaire, le cis-clivage dépendant du domaine Ruvc montre une préférence pour la chaîne non complémentaire, cohérente avec la dégradation trans de ssDNA non spécifique. Ces résultats suggèrent que le cis-clivage et le trans-clivage dépendants du domaine Ruvc pourraient partager un mécanisme de clivage similaire.

Une comparaison détaillée de l’activité de trans-clivage de Cas9, Cas12a et Cas13a montre que bien qu’ils présentent différentes affinités de liaison aux substrats et différentes efficacités catalytiques, ils ont des limites de détection similaires pour la détection libre d’amplification des oligonucléotides cibles ADN et ARN. Par rapport aux plateformes basées sur Cas12 et Cas13a, la plateforme de détection basée sur Cas9 pourrait offrir certains avantages.

Dans l’ensemble, notre recherche apporte de nouvelles perspectives sur la détection des acides nucléiques médiée par Cas9, tout en fournissant de nouvelles considérations pour l’application de Cas9 dans l’édition génomique. Bien que notre étude ait seulement confirmé l’activité de trans-clivage de Cas9 in vitro, nous ne pouvons pas exclure la possibilité que cela se produise également in vivo, influençant potentiellement l’édition génomique. Par conséquent, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour déterminer si cette activité affecte l’édition génomique d’autres espèces lors de l’utilisation de CRISPR-Cas9.