ディープロングリードRNA-Seqを用いた高齢者前頭葉皮質における医学的に関連するRNAアイソフォームの多様性のマッピング

2024-07-10 Wed
RNAアイソフォーム前頭葉皮質長読長RNAシーケンシングアルツハイマー病差次的発現
学術的背景RNA選択的スプライシング（RNAアイソフォーム）は、遺伝子発現の調節において重要な役割を果たしています。ヒトのタンパク質コーディング遺伝子は平均して8つ以上のRNA選択的スプライシングを含み、これにより約4つのユニークなタンパク質コーディング配列が生じます。従来の短読長シーケンシング技術は読取り長の制限により、RNA選択的スプライシングを正確に組み立てて定量することができず、基礎生物学の理解が大幅に簡略化されていました。ますます多くの研究が、同じ遺伝体の異なる選択的スプライシングがタンパク質レベルでユニークな相互作用ネットワークを持っていることを示しています。特に、同じ遺伝体の一部の選択的スプライシングが細胞内で全く異なる、あるいは逆の機能を果たすことが示されています。例えばbcl-x遺伝子では、bcl-xlは抗アポトーシス機能を持つ一方で、bcl-xsは促アポトーシス機能を持っています。このように、個々のRNA選択的スプライシングの機能を明確にすることは、病気のメカニズムを理解し、新しい治療法を開発する上で非常に重要です。
研究の出典本研究は、ケンタッキー大学、エモリー大学などの機関からのBernardo Aguzzoli Heberle、J. Anthony Brandon、Madeline L. Pageなどの複数の科学者によって共同で行われました。論文はNature Biotechnology誌に発表され、DOIはhttps://doi.org/10.1038/s41587-024-02245-9です。
研究のワークフロー本研究の目的は、ディープロングリードシーケンシング技術を用いて、人間の前頭葉皮質における医療関連遺伝子のRNA選択的スプライシングの多様性を探求することです。研究のワークフローは以下のステップに分かれています：
サンプル採取と処理12個の高齢者前頭葉皮質の検死サンプルを収集しました。そのうち6個はアルツハイマー病（AD）サンプル、6個は対照群サンプルです。各サンプルはOxford Nanopore PromethIONフローセルを使用してシーケンスしました。
RNA抽出とシーケンシングOxford Nanopore TechnologiesのPCR拡張cDNAキットを利用して、ポリ（A）リッチ後のmRNAシーケンシングを行いました。シーケンシングデータ処理にはGuppy basecallerソフトウェアを使用して、生成された.fast5ファイルをベースコールしました。
データ分析とRNA選択的スプライシングの定量Bambuソフトウェアを利用して、シーケンシングデータのRNA選択的スプライシングの定量と新しい選択的スプライシングの発見を行いました。12個のサンプルから合計28989個の発現するRNA選択的スプライシングを識別し、そのうち20183個がタンパク質コーディング遺伝子、2303個が長い非コーディングRNAと分類されました。
タンパク質レベルの検証新しく発見されたRNA選択的スプライシングを検証するために、既存の質量分析データおよび他の研究データを使用しました。新しく発見された選択的スプライシングの一部は、タンパク質レベルで成功裏に検証されました。
新選択的スプライシングと差異発現分析既知の核ゲノムから1534個の新しい選択的スプライシングを発見し、そのうち428個は高信頼度の新しい選択的スプライシングと分類されました。差異発現分析では、99個の選択的スプライシングがアルツハイマー病サンプルと対照群サンプルの間で差異発現を示しました。これらの差異発現する選択的スプライシングの大部分は、遺伝子レベルで発現の差異が見られなかった遺伝子から来ています。
研究結果新RNA選択的スプライシングの発見Bambuソフトウェアを使用して1534個の新RNA選択的スプライシングを識別し、スクリーニングと検証を経て、428個が高信頼度の新RNA選択的スプライシングと分類されました。これらの新しい選択的スプライシングは、主にタンパク質コーディング遺伝子から発見されました。これらの選択的スプライシングは、ロングリードシーケンシングデータでより多くの異質性を示しました。
差異発現のRNA選択的スプライシングアルツハイマー病サンプルと対照群の間で、176個の差異発現遺伝子と105個の差異発現RNA選択的スプライシングを発見しました。その中で、tnfsf12遺伝子の2つの選択的スプライシングは逆の発現傾向を示し、疾患研究において選択的スプライシングレベルの差異発現分析が重要であることをさらに示しています。
選択的スプライシングの多様性と臨床的関連性研究は、7042個の遺伝子が2つ以上の選択的スプライシングを発現し、1917個の医療関連遺伝子が多様性選択的スプライシングを示すことを明らかにしました。これらの発見は、医療研究や臨床診断