剪接体GTP酶EFTUD2缺陷触发的铁死亡导致浦肯野细胞退化

2024-11-11 Mon
EFTUD2缺乏触发小脑蒲肯野细胞铁死亡引发的细胞退化小脑在运动协调和高级认知功能中扮演着重要角色，而小脑蒲肯野细胞（Purkinje Cell，PC）的健康对小脑的功能维持至关重要。基于替代性剪接（Alternative Splicing，AS）的基因调控在神经系统的发育过程中起到关键作用，尤其是在维持PC存活方面。研究发现，剪接体（spliceosome）和RNA结合蛋白（RBP）的异常会导致一系列神经发育和退行性疾病，包括PC的快速退化。这项研究的核心是EFTUD2基因，这是剪接体中一个关键的GTP酶，在RNA剪接过程中不可或缺。此前的研究已表明，EFTUD2突变可导致一种名为下颌面骨发育不良伴小头畸形（Mandibulofacial Dysostosis with Microcephaly，MFDM）的综合征。该综合征会导致小脑发育不良和运动障碍，但EFTUD2缺乏引发这些症状的具体分子机制尚不明确。
本研究由Guochao Yang及其团队开展，来自北京基础医学研究所、山东大学等多家机构，文章发表于《Neuron》期刊。研究的目的是明确EFTUD2在小脑PC生长和存活中的作用，以及它是如何通过抑制铁死亡（ferroptosis）来维持PC功能。研究团队通过构建PC特异性EFTUD2敲除小鼠模型（EFTUD2 cKO）探索了EFTUD2缺乏导致的细胞损伤机制，并验证了抑制铁死亡是否可以拯救PC缺乏带来的退化性症状。
研究方法实验流程与设计本研究包括多个关键实验步骤，旨在从细胞到整体水平研究EFTUD2的功能。
PC特异性EFTUD2敲除小鼠模型的构建：
研究团队通过交叉EFTUD2f/f小鼠与L7-Cre小鼠，获得了PC特异性EFTUD2敲除小鼠（EFTUD2 cKO）。在这些小鼠中，EFTUD2被特异性敲除，以便观察其对PC结构与功能的影响。
形态与功能检测：
通过免疫荧光染色和组织染色技术，研究人员检测了EFTUD2 cKO小鼠PC的数量和形态变化。实验显示，敲除EFTUD2的小鼠小脑在发育过程中体积减小，PC数量显著减少，且出现了运动协调障碍。此外，研究团队进行了加速旋转杆、平衡横杆测试等行为学实验，以评估小鼠运动协调和社交行为的变化。
基因表达与分子机制分析：
研究通过RNA测序（RNA-seq）和单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析敲除EFTUD2对小脑PC基因表达的影响。通过差异表达基因的基因富集分析，发现EFTUD2 cKO小鼠在脂质代谢、氧化应激和铁死亡相关基因表达上出现显著变化。
铁死亡信号途径的检测：
实验还对细胞内活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）水平和线粒体形态进行了观察，发现敲除EFTUD2后小鼠PC中ROS水平显著增加，线粒体体积缩小并破裂，这是铁死亡的典型特征。
铁死亡抑制实验：
为进一步验证铁死亡在EFTUD2缺乏导致PC死亡中的作用，研究团队对小鼠进行了铁死亡抑制剂ferrostatin-1（Fer-1）和维生素E（Vitamin E）治疗。实验结果显示，这些抑制剂有效缓解了PC的退化并改善了小鼠的运动障碍。
主要发现EFTUD2缺乏触发PC铁死亡并导致小脑发育不良：
EFTUD2 cKO小鼠的小脑中，PC数量显著减少，且伴随着小脑萎缩。这种现象与MFDM患者的症状相似，揭示了EFTUD2在维持PC结构和功能中的关键作用。
EFTUD2通过调节脂质代谢抑制铁死亡：
研究发现，EFTUD2缺乏导致抗铁死亡基因SCD1（硬脂酰辅酶A去饱和酶1）和GCH1（GTP环化水解酶1）表达下调，表明其通过调控单不饱和脂肪酸（Monounsaturated Fatty Acids，MUFAs）磷脂和抗氧化活性来抑制铁死亡。
通过p53非依赖性途径抑制铁死亡：
实验发现，EFTUD2缺乏引发的铁死亡是通过p53非依赖性途径进行的。虽然p53通常在细胞凋亡和铁死亡调控中扮演重要角色，但本研究结果表明EFTUD2通过下调SCD1和GCH1而非依赖p53信号通路来抑制铁死亡。
EFTUD2敲除引发ATF4的错误剪接，进一步影响抗铁死亡基因：
RNA-seq和长读长RNA测序表明，EFTUD2缺乏导致了ATF4（活化转录因子4）基因的错误剪接，使得其功能受损。由于ATF4直接调控SCD1和GCH1的表达，这种剪接错误进一步降低了抗铁死亡基因的表达水平。
铁死亡抑制有效改善PC退化：
EFTUD2 cKO小鼠在应用铁死亡抑制剂后，PC存活率显著提高，运动行为也得到改善。此外，EFTUD2和ACSL4（长链酰基辅酶A合成酶家族成员4）的双敲除小鼠也表现出明显的退化缓解，进一步证实了铁死亡在EFTUD2缺乏引发PC退化中的作用。
研究意义本研究揭示了EFTUD2在小脑PC存活中的重要功能，并指出EFTUD2通过抑制铁死亡来维持PC结构和功能，为MFDM和其他神经退行性疾病的潜在治疗方案提供了新思路。EFTUD2通过调控SCD1和GCH1的表达减少了细胞内脂质过氧化和ROS水平，从而通过一种全新的非p53依赖性途径阻止了铁死亡的发生。研究结果表明，铁死亡抑制剂的应用或有望成为治疗EFTUD2缺乏导致的小脑退行性疾病的新方法。此外，研究还表明对小脑发育异常的检测和早期干预对MFDM患者具有潜在的临床价值。
研究亮点发现EFTUD2在PC铁死亡中的抑制作用及其机制：
通过PC特异性敲除EFTUD2的模型，研究首次揭示了EFTUD2通过非p53依赖性途径抑制铁死亡的分子机制。
提出铁死亡抑制剂为EFTUD2缺乏相关疾病的潜在治疗手段：
铁死亡抑制剂如Fer-1和维生素E的治疗在小鼠模型中取得良好效果，为EFTUD2相关的退行性疾病提供了新的治疗思路。
探索了铁死亡在神经系统发育中的重要性：
本研究将铁死亡与小脑发育及运动协调功能障碍直接关联，拓展了铁死亡在神经发育与退行性疾病研究中的应用范围。
结论本研究阐明了EFTUD2缺乏引发的PC铁死亡机制，并提供了抑制铁死亡的治疗潜力。通过研究剪接体GTP酶EFTUD2与铁死亡途径的关系，进一步揭示了RNA剪接在神经细胞存活和神经发育中的重要性。