小分子激活剂与单PR65蛋白结合的直接观察

2025-01-27 Mon
单分子光学镊子技术揭示小分子激活剂与PR65蛋白的结合机制学术背景蛋白质磷酸酶2A（PP2A）是一种关键的细胞信号调节酶，其功能失调与多种癌症和慢性疾病（如阿尔茨海默病和慢性阻塞性肺病）密切相关。因此，PP2A的重新激活被认为是治疗这些疾病的重要策略。近年来，小分子激活剂（SMAPs）被开发用于直接结合PP2A的支架亚基PR65，从而恢复其功能。然而，PR65与小分子激活剂之间的结合机制及其对蛋白质构象的影响尚不明确。为了解决这一问题，研究人员利用单分子光学镊子技术（NOTs）结合分子动力学模拟（MD），深入研究了小分子激活剂ATUX-8385与PR65的结合动力学及其对蛋白质构象的影响。
论文来源本论文由Annie Yang-Schulz、Maria Zacharopoulou、Semazeynep Yilmaz等来自University of Victoria、University of Cambridge、Stony Brook University等多个机构的科研团队共同完成，并于2025年发表在npj Biosensing期刊上。该研究得到了多个基金的支持，包括HFSP（RGP0027/2020）和BBSRC（BB/T002697/1）。
研究流程与结果1. 研究流程a) 单分子光学镊子实验研究人员使用双纳米孔光学镊子（DNH-NOTs）技术，在无标记条件下直接观察ATUX-8385与PR65的结合过程。实验步骤如下：
1. 样品制备：PR65蛋白在5% DMSO溶液中与20 μM ATUX-8385混合。
2. 光学镊子捕获：通过激光束聚焦在双纳米孔上，捕获单个PR65蛋白分子。
3. 信号记录：使用雪崩光电二极管（APD）记录蛋白质在结合前后的光散射信号变化。
4. 数据分析：通过隐马尔可夫模型（HMM）分析信号，区分结合态和非结合态，并计算结合和解离速率常数。
b) 分子动力学模拟为了验证实验结果，研究人员进行了分子动力学模拟：
1. 对接模拟：使用Rosetta和AutoDock Vina软件，将ATUX-8385对接至PR65的潜在结合位点。
2. 分子动力学模拟：对PR65的apo状态和ATUX-8385结合状态分别进行了总计4.224微秒的模拟，分析蛋白质构象变化。
3. 结合位点验证：模拟结果显示，ATUX-8385稳定结合在PR65的第4和第5螺旋重复区域，并倾向于使PR65形成延伸构象。
c) 生物物理表征为了进一步验证结合特性，研究人员还使用了以下技术：
1. 纳米差示扫描荧光法（nanoDSF）：测量PR65在ATUX-8385存在下的熔解温度变化，显示结合后蛋白质稳定性增加。
2. 荧光偏振实验：通过荧光偏振技术测定ATUX-8385与PR65的结合常数（Kd），结果为9.4 ± 1.4 μM，与单分子实验结果一致。
3. 核磁共振（NMR）：通过19F NMR检测ATUX-8385与PR65的结合，证实了结合事件的发生。
2. 主要结果a) 单分子实验结果结合动力学：通过NOTs技术，研究人员测得ATUX-8385与PR65的解离常数（Kd）为13.6 ± 2.5 μM，与荧光偏振实验结果一致。
构象变化：结合ATUX-8385后，PR65的光散射信号显著增加，表明蛋白质构象从紧凑态转变为延伸态。
b) 分子动力学模拟结果结合位点：ATUX-8385稳定结合在PR65的第4和第5螺旋重复区域，验证了实验结果的可靠性。
构象稳定性：模拟显示，ATUX-8385结合后，PR65倾向于形成延伸构象，与实验观察到的光散射信号增加一致。
c) 生物物理表征结果nanoDSF：ATUX-8385结合后，PR65的熔解温度从52.7 ± 0.1 °C升至53.5 ± 0.1 °C，表明蛋白质稳定性增加。
荧光偏振：测得的Kd值为9.4 ± 1.4 μM，与单分子实验结果高度一致。
NMR：19F NMR信号强度的变化进一步证实了ATUX-8385与PR65的结合。
3. 结论与意义本研究通过单分子光学镊子技术结合分子动力学模拟，首次在单分子水平上揭示了ATUX-8385与PR65的结合机制及其对蛋白质构象的影响。研究结果表明，ATUX-8385通过稳定PR65的延伸构象，促进PP2A的重新激活。这一发现不仅为PP2A相关疾病的治疗提供了新的分子机制见解，还展示了单分子光学镊子技术在药物发现中的巨大潜力。
4. 研究亮点单分子水平的研究：首次在单分子水平上观察ATUX-8385与PR65的结合动力学。
多技术验证：结合NOTs、MD模拟、nanoDSF、荧光偏振和NMR等多种技术，全面验证了实验结果。
药物发现应用：展示了单分子光学镊子技术在药物筛选和结合动力学研究中的应用价值。
5. 其他有价值的信息温度调控：NOTs技术可以通过调节激光功率实现局部温度调控，未来可用于研究温度对结合动力学的影响。
数据公开：研究数据和代码已公开在GitHub上（https://github.com/nanoplasmonics/smaps），便于其他研究人员验证和进一步研究。
总结本研究通过创新的单分子光学镊子技术，揭示了小分子激活剂ATUX-8385与PR65蛋白的结合机制及其对蛋白质构象的影响。这一成果不仅深化了对PP2A激活机制的理解，还为药物发现提供了新的研究工具和方法。