动物神经元快速形态动力学的超分辨率成像

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超分辨成像揭示小鼠脑内神经形态动力学的新进展：头固定清醒动物的动态观察

背景介绍

神经科学研究领域中，神经元的形态变化及其功能动态是理解大脑信息处理和网络塑性的关键。然而，尽管神经元的树突棘（dendritic spines）、轴突末端（axonal boutons）和突触结构在动物学习和行为适应中发挥着重要作用，这些结构在活体中的动态观测依然是一个重大挑战。受限于传统显微成像方法的分辨率和拍摄速度，许多关于神经元微小结构的研究只能停留在固定组织或培养细胞层面，这限制了我们了解塑性变化如何与自然行为和生理状态相关联。

近年来，超分辨显微镜（super-resolution microscopy, SRM）的引入突破了传统光学成像的衍射极限，拉近了研究神经网络超微结构与活体动态行为之间的距离。然而，由于活体动物的运动伪影和成像速度限制，超分辨成像在清醒动物中的应用仍然困难重重。已有一些研究尝试通过麻醉动物的方法来降低伪影，使用模拟耗尽发射显微镜（STED）观察麻醉小鼠大脑，但麻醉状态改变了神经系统的正常生理功能，无法反映动物在自然行为状态下的真实神经动力学。

在此背景下，Yujie Zhang等人带领的研究团队开发了一种名为多重线扫描结构光照显微镜（multiplexed, line-scanning structured illumination microscopy, MLS-SIM），以解决上述难题。这项创新技术为超分辨显微技术在头固定清醒动物中的应用打开了新的大门。

论文来源

这篇研究论文题为“Super-resolution imaging of fast morphological dynamics of neurons in behaving animals”，作者包括Yujie Zhang、Lu Bai和Kai Wang等，来自中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心及上海科技大学生命科学与技术学院等机构。论文发表于 Nature Methods （doi: https://doi.org/10.1038/s41592-024-02535-9），刊载于2025年1月的《Nature Methods》期刊第22卷。

研究流程及方法

研究对象及实验总体设计

研究团队的主要目标是开发并验证一种能够在头固定清醒动物中实现长时间纵向超分辨成像的新方法，并利用该方法研究树突棘与轴突末端动态。实验主要分为技术开发、分辨率表征及多维应用三个部分。

  1. 开发MLS-SIM技术
    MLS-SIM结合了传统结构光照显微镜（Structured Illumination Microscopy, SIM）的优点，并进行了若干创新。该技术采用两种独特的线扫描激发模式，每种模式通过二维结构光图案增强某一特定方向上的分辨率，同时实现背景排除与快速采样。为了配合这种多模式扫描，作者设计了一种新的重建算法，使得原始的低分辨率数据可以有效解卷积为最终高分辨率图像。

  2. 成像分辨率与运动容忍度的表征
    作者使用带有膜标签的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标记模型动物（斑马鱼和小鼠）的Purkinje细胞，表征MLS-SIM的横向（大约150纳米）和轴向（约450纳米）分辨率。通过在不同运动速度（包括高达100 μm/s）和信噪比条件下测试，该方法成功展示了其抗运动伪影的能力。

  3. 头固定清醒小鼠中的应用
    为验证临床应用价值，作者通过小鼠睡眠-觉醒周期的脑内成像，研究了树突棘和轴突末端的形态学动态变化。此外，通过双颜色成像，他们观察了PSD-95亚结构（突触后膜蛋白95，常用作突触成熟的标志物）及其与神经形态学的相关性。

数据重建与算法创新

MLS-SIM图像重建基于多层联合去卷积算法，专门针对不同扫描模式下的点扩散函数（PSFs）进行优化。研究团队将每个二维图像分割为多个组别，按照不同的有效PSFs重建成像层，最终通过多层3D拼接生成全解析度图像。相比现有方法，MLS-SIM的设计大幅减小了单帧时序所需的采样数量，从而增强了抗运动能力。

研究结果与数据分析

  1. 分辨率与运动容忍度

    • 在静态样本测试中，MLS-SIM的横向分辨率测得为120-150纳米，与现有的SIM方法相当。
    • 在动态测试下的容忍度表现优越：即使样本以50 μm/s速度运动，也能保持100纳米级分辨率；在100 μm/s速度下，非运动方向的分辨率依然接近静态条件表现。

  2. 神经形态学动态观测

    • 树突棘：通过长达20分钟的时间序列成像，观察到62%的树突棘生成了动态伸展的spinules。这些spinules尺寸较小，探索范围约为1 μm，大部分短暂存在，且与其生命周期呈正相关。
    • 轴突末端：除树突棘外，对兴奋性轴突末端的成像表明47%的亚端结构拥有类似spinules的小型突起，部分动态变化达秒级。

  3. PSD-95双颜色成像

    • PSD-95蛋白分布的形态从简单点状到复杂多域高度多样，且主要分布于枝干树突基部和树突棘头内部。在长达30分钟的观察中，75%以上的PSD-95分布点与小型突起形态建立强相关，而这些相互作用可能是树突棘形成和突触成熟的重要共谋机制。

  4. 睡眠-觉醒周期动态

    • 作者通过监测脑电图（EEG）和肌电图（EMG），捕获了小鼠大脑在快速眼动和非快速眼动睡眠状态下树突和轴突的形态学变化。结果表明，睡眠状态虽未导致显著树突棘面积变化，但在特定周期内spinules的数量有所波动，提示大脑休眠可能对突触可塑性呈现特定模式的影响。

推论与启示

  1. 科学意义：
    MLS-SIM允许科学家实现清醒状态下神经元形态学的高精度成像，有助于解析大脑在自然行为环境下的塑性变化，拉近了超分辨技术在神经科学中的应用与理论知识间的距离。

  2. 技术价值：
    传统超分辨技术在清醒动物中的应用受限于运动伪影和低信噪比，而MLS-SIM通过创新的光学设计与算法实现了成像稳定性与分辨率的兼顾。

  3. 新颖发现：
    研究动态证明了小型突起（如spinules）在分秒级的快速形成、消退及其与PSD-95亚结构的相关性。这种动态变化被认为与突触成熟、断裂和大脑网络可塑性有密切关联。

  4. 未来应用：
    除神经科学外，MLS-SIM可广泛应用于动态研究如心脏跳动和肺部呼吸等结构，这为未来的医学诊断及组织工程研究提供了新工具。

总结

这项研究不仅在技术上实现了超分辨显微在头固定清醒小鼠的成功应用，更使得神经结构与分子动力学的相关性得到了深入解读。MLS-SIM作为开创性工具，为未来研究方案提供了理论支撑，尤其在深入探讨神经网络如何调控行为和记忆机制时具有深远意义。