亨廷顿病中的异常剪接伴随TDP-43活性破坏和m6A RNA修饰改变

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亨廷顿病 TDP-43 m6A RNA修饰 异常剪接 神经退行性疾病

亨廷顿病中的异常剪接与TDP-43功能失调及m6A RNA修饰改变

学术背景

亨廷顿病（Huntington’s disease, HD）是一种常染色体显性遗传的神经退行性疾病，主要表现为运动、认知和精神症状。该病由HTT基因中的CAG重复扩增引起，导致亨廷顿蛋白（huntingtin, HTT）中多聚谷氨酰胺重复序列的异常扩展。尽管HTT基因的突变机制已被广泛研究，但HD中RNA加工异常的机制仍不清楚。特别是，RNA剪接异常在HD中的具体作用尚未完全阐明。近年来，RNA结合蛋白（RNA-binding proteins, RBPs）和RNA修饰（如m6A甲基化）在神经退行性疾病中的作用逐渐受到关注。TDP-43（TAR DNA-binding protein 43）是一种在肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTLD）中起关键作用的RNA结合蛋白，但其在HD中的功能尚不明确。

本研究旨在探讨TDP-43和m6A RNA修饰在HD中的调控作用，揭示它们在HD中RNA剪接异常中的潜在机制。

论文来源

这篇论文由Thai B. Nguyen、Ricardo Miramontes等多位作者共同完成，作者团队来自多个研究机构，包括University of California, Irvine、Ludwig Institute for Cancer Research等。该研究于2025年2月发表在Nature Neuroscience期刊上，论文标题为“Aberrant splicing in Huntington’s disease accompanies disrupted TDP-43 activity and altered m6A RNA modification”。

研究流程与结果

1. HD小鼠模型中的RNA加工异常

研究首先在HD的R6/2转基因小鼠模型中进行了RNA测序（RNA-seq），分析了3个月大的小鼠纹状体和皮质中的RNA剪接变化。结果显示，HD小鼠中出现了大量的剪接异常事件，特别是外显子跳跃（exon skipping）现象显著增加。通过RMATS（RNA-seq multivariate analysis of transcript splicing）工具，研究者在皮质和纹状体中分别鉴定出了9033和10074个显著的剪接事件。进一步的GO（Gene Ontology）分析表明，这些剪接异常主要涉及神经元突触传递相关的基因。

为了验证这些剪接变化，研究者使用了RASL-seq（RNA-mediated oligonucleotide annealing, selection and ligation with next-generation sequencing）技术，在R6/2小鼠以及其他两种HD模型（Q150和Q175）中进行了剪接事件的分析。结果显示，HD小鼠中外显子跳跃事件显著增加，且这种变化呈现出剂量依赖性和年龄依赖性。

2. TDP-43和m6A基序在HD小鼠中的富集

为了探讨剪接异常的潜在机制，研究者进行了de novo基序分析，发现HD小鼠中跳跃的外显子富含UG/GU基序，这些基序是TDP-43的结合位点。此外，还发现了m6A的经典基序DRACh（D = A/G/U, R = A/G, H = A/C/U），表明m6A修饰可能在HD的剪接调控中发挥作用。

3. 未注释的剪接事件在HD中的发现

研究者进一步使用MAJIQ和LeafCutter工具，分析了HD小鼠皮质和纹状体中的未注释剪接事件。结果显示，约50%的剪接变化是未注释的，这些变化主要涉及神经元发育和功能相关的基因。通过单细胞RNA-seq和长读长测序（PacBio Iso-seq），研究者验证了这些未注释剪接事件的存在，并发现它们与TDP-43的缺失密切相关。

4. TDP-43结合在HD中的减弱

为了研究TDP-43在HD中的作用，研究者进行了TDP-43的eCLIP-seq（enhanced crosslinking and immunoprecipitation sequencing）实验，分析了HD小鼠和正常小鼠皮质和纹状体中的TDP-43结合位点。结果显示，HD小鼠中TDP-43的结合显著减少，特别是在那些下调的基因中。此外，TDP-43的结合位点与m6A修饰位点紧密相关，表明TDP-43的功能可能依赖于m6A修饰。

5. HD小鼠和人类大脑中TDP-43的核定位减少

通过免疫荧光染色，研究者发现HD小鼠和人类患者大脑中TDP-43的核定位显著减少，且磷酸化的TDP-43（pTDP-43）在细胞质中积累。此外，研究者还发现了一种新的核内pTDP-43聚集样结构（aggregation-like bodies, AL bodies），这些结构与HTT蛋白共定位，提示TDP-43的异常聚集可能是HD病理的一部分。

6. m6A修饰在HD中的异常

研究者进一步分析了HD小鼠中的m6A修饰变化。通过m6A eCLIP-seq，发现HD小鼠中m6A修饰位点显著减少，特别是在那些下调的基因中。此外，m6A修饰的减少与TDP-43结合的减少密切相关，表明m6A修饰可能在HD中调控TDP-43的功能。

结论与意义

该研究揭示了TDP-43功能失调和m6A RNA修饰异常在HD中RNA剪接异常中的重要作用。研究表明，TDP-43的核定位减少和磷酸化TDP-43的细胞质积累是HD病理的关键特征。此外，m6A修饰的减少可能通过影响TDP-43的结合来调控基因表达和剪接。这些发现为HD的病理机制提供了新的见解，并提示TDP-43和m6A修饰可能成为HD治疗的潜在靶点。

研究亮点

  1. TDP-43在HD中的功能失调：研究首次系统性地揭示了TDP-43在HD中的功能失调，特别是其核定位减少和磷酸化TDP-43的细胞质积累。
  2. m6A修饰的异常：研究发现m6A修饰在HD中显著减少，且这种变化与TDP-43的结合密切相关，提示m6A修饰在HD中的调控作用。
  3. 未注释剪接事件的发现：通过单细胞RNA-seq和长读长测序，研究者发现了大量未注释的剪接事件，这些事件与HD的病理密切相关。
  4. 新的核内pTDP-43聚集样结构：研究者首次在HD患者大脑中发现了核内pTDP-43聚集样结构，这些结构可能与HD的病理进展有关。

研究价值

该研究不仅揭示了TDP-43和m6A修饰在HD中的重要作用，还为HD的病理机制提供了新的见解。这些发现为开发针对TDP-43和m6A修饰的治疗策略提供了理论基础，具有重要的科学和应用价值。