携带C9orf72重复扩展突变患者小脑中丰富的转录组变化

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C9orf72 肌萎缩侧索硬化症 额颞叶变性 转录组学 隐秘外显子

研究背景

在神经科学领域，amyotrophic lateral sclerosis (ALS) 和 frontotemporal lobar degeneration (FTLD) 是两种具有高度异质性的神经退行性疾病。研究表明，在这些疾病中，c9orf72基因中的非编码六核苷酸重复扩展是最常见的遗传原因。然而，这种重复扩展在转录组层面的具体后果仍不完全清楚。尽管已有研究揭示c9orf72重复扩展可能通过减少基因表达、形成RNA焦点和聚合二肽重复蛋白（DPR）等机制引发疾病，但这些机制何以导致广泛的临床和病理学变异，目前尚无定论。

近来，研究人员逐渐注意到小脑在ALS和FTLD研究中的重要性。尽管小脑传统上被认为在这些疾病中较为不受影响，最新的研究表明，TDP-43蛋白在这一脑区的水平有所降低，而RNA焦点和DPR蛋白在小脑中广泛存在。因此，研究小脑组织的转录组改变有助于揭示在神经元大量死亡的主要受影响脑区中可能被掩盖的病理机制。

由Mayo Clinic的Evan Udine等人所发表的这项研究，旨在通过转录组测序技术确认和分析c9orf72重复扩展患者的小脑中的转录组改变，以期进一步理解ALS和FTLD的发病机制。论文发表于”Acta Neuropathologica”期刊，展示了对患者的样本通过RNA测序（RNA-seq）分析的结果，并揭示了许多新发现，挖掘了与神经退行性疾病相关的潜在分子机制。

研究流程

本研究的主要流程如下：

  1. 样本收集和RNA提取

研究使用了来自Mayo Clinic脑库的193个小脑组织样本，包括60个c9orf72重复扩展患者、108个非c9orf72重复扩展患者以及25个无神经疾病的对照样本。样本的RNA通过rRNAseasy Plus Kit（Qiagen）进行提取，并在测序前进行了质量控制，确保RNA完整性数值(RIN值)均在6.0以上。

  1. RNA测序和数据处理

利用Illumina HiSeq 4000平台进行RNA测序，得到了193个样本的RNA-seq数据。数据使用Map-RSeq (v3.1.3) 和 STAR aligner (v2.5.2c)进行处理，将读取比对到参考人类基因组(hg38)。基因和外显子表达量通过Subread (v1.5.1)计算，得到原始读取计数和每基因组百万读取数(RPKM)。

  1. 数据标准化和差异表达基因分析

使用条件分位数标准化(CQN)，去除了低表达和不表达的基因。随后，利用线性回归模型进行了差异表达基因分析，考虑了性别、基因计数、RIN值、年龄等变量，并使用了5种主要脑细胞类型的标记基因作为共变量。

  1. 共表达分析

使用加权基因共表达网络分析(WGCNA)对数据进行共表达分析，识别与疾病状态相关的基因模块。不同模块代表了不同的生物学过程，如小分子代谢、线粒体组织、蛋白质定位等。

  1. 差异剪接分析

使用LeafCutter (v0.2.6) 进行差异剪接分析，识别了大量的差异剪接事件，包括特定基因中的外显子跳跃和隐秘剪接。

  1. 免疫荧光染色和确认实验

对12个样本进行了Olig2+细胞的免疫荧光染色，以确认通过反卷积分析发现的少突胶质细胞比例变化。通过cDNA测序和长读取RNA-seq对部分隐秘外显子进行了验证。

主要结果

  1. 基因表达的差异

研究发现，与对照组相比，c9orf72重复扩展患者中有6911个基因表现出显著的差异表达，其中包含多种已知与ALS和FTLD相关的基因，如c9orf72、TARDBP（编码TDP-43）和FUS等。在疾病相关模块的共表达分析中，小分子代谢过程和RNA处理路径显示出显著关联，提示这些生物通路在疾病中的关键作用。

  1. 转录剪接的变化

在剪接分析中，发现了多个与ALS和FTLD相关基因的差异剪接事件，包括CAMTA1和DCTN1，这些基因在同样的疾病谱中起作用。例如，CAMTA1的外显子跳跃现象与ALS存活时间的临床修正因子有关。

  1. 隐秘外显子

通过分析，c9orf72重复扩展患者中的隐秘外显子显著多于非c9orf72患者和对照组，105个隐秘剪接事件中77个集中在c9患者中。进一步研究显示，这些隐秘剪接事件可能与RNA结合蛋白（如TDP-43）表达水平相关。

  1. 细胞类型比例的变化

反卷积分析和免疫染色结果提示，c9orf72重复扩展患者中少突胶质细胞比例可能有所降低，这也许与疾病的病理机制有关。

研究结论

这项研究揭示了c9orf72重复扩展患者小脑中的广泛转录组变化，特别是基因表达和RNA剪接的扰动。这些发现进一步表明，尽管缺乏显著的神经元死亡，小脑在ALS和FTLD的病理过程中扮演了重要角色。此外，研究确认了多种已知和潜在的疾病相关基因的差异表达和剪接改动，为理解这些复杂疾病的分子机制提供了新的视角。

研究强调了在不同脑区进行转录组和功能研究的重要性，并为未来的研究指明了方向，如利用单细胞测序和长读取测序技术进一步探讨病理特征和转录变化之间的关联。

通过对转录组数据进行深入分析，研究为理解ALS和FTLD的异质性提供了新的见解，并可能为未来的治疗策略开发提供理论支持。