CD8+ T细胞亚群在缺血性卒中后神经炎症中的长期作用

背景介绍

缺血性卒中是引发死亡和残疾的主要原因之一。在卒中发生后，神经炎症迅速诱发，激活了多种细胞如肥大细胞、星形胶质细胞、微胶质细胞和血管内皮细胞，这些反应性细胞继而表达多种炎症介质，引导白细胞进入大脑病变核心和周围区域（Jayaraj等，2019）。在浸润的白细胞中，T细胞在特异性抗原依赖和独立的条件下，对卒中后的神经元损伤具有不可忽视的作用（Selvaraj & Stowe，2017；Zhang等，2021）。先前的研究已经证明，在亚急性阶段（48小时到7天）以及晚期阶段（>7天）T细胞迁移和存在于受伤侧的大脑中显著影响了卒后神经炎症（Liesz等，2013；Shi等，2021）。

在最近的研究中，发现CD8+ T细胞在脑外伤后的长期累积导致了神经元的长时间损伤（Daglas等，2019），并且延迟去除CD8+ T细胞可以改善卒中后的功能恢复（Selvaraj等，2021）。然而，这些T细胞亚群在卒中后神经炎症中的具体作用仍未明确。本文填补了这一研究空白，探索了CD8+ T细胞亚群在卒中后长时间神经炎症中的潜在作用。

论文来源

本文的作者是Long Shu、Hui Xu、Jiale Ji、Yuhan Xu、Ziyue Dong、Yuchen Wu和Yijing Guo，分别来自东南大学中大医院神经内科和中国三峡大学附属仁和医院神经内科。本文于2024年4月9日被《Neuromolecular Medicine》期刊接收，并在2024年第26卷第17页发表。

研究流程

本研究使用了C57BL/6J小鼠作为实验对象，建立了短暂中动脉闭塞（tmcao）模型。实验流程包括以下步骤：

1. tmcao模型建立：

   • 小鼠在吸入2.0%的异氟烷麻醉下进行手术，采用硅胶包被的单丝在左侧颈内动脉中推进至中动脉起始处进行90分钟的闭塞。手术全过程监测脑血流量（CBF），是手术成功的标准。
   • 术后小鼠被分为两个组：第一个组在术后第3天收集脾细胞和受伤侧免疫细胞，第二组在术后第30天进行相同处理。

2. 免疫细胞收集与处理：

   • 小鼠被CO_2安乐并进行心脏灌注以去除循环血细胞。脾脏和受伤侧大脑被切成小块并进行消化，消化后的单细胞悬液通过淋巴细胞分离液进行分离并用于后续实验。

3. 流式细胞术分析：

   • 对收集的细胞进行表面标志物和细胞内蛋白质的染色，使用BD LSR ii流式细胞仪分析细胞并分离CD8+ T细胞亚群。细胞的初级激活通过加入PM A和离子霉素进行。

4. RNA提取和实时PCR：

   • 使用RNA提取试剂盒提取总RNA，逆转录合成cDNA，随后通过实时PCR定量炎症介质的转录水平。

5. 共培养实验：

   • 验证CD8+ T细胞亚群对微胶质细胞的影响。分别将分离出的CD8+ T细胞亚群与正常小鼠脑的CD45lowCD11b+微胶质细胞共培养24小时，随后提取共培养微胶质细胞的RNA进行实时PCR分析。

6. 免疫荧光成像：

   • 使用免疫荧光标记验证在脑组织切片和培养微胶质细胞中的CD8+ T细胞和GFAP（星形胶质细胞标记物）表达情况。

研究结果

CD8+ T细胞的长期存在

在术后第3天和第30天从脾脏和受伤侧大脑收集免疫细胞。结果显示，随着时间推移，受伤侧大脑中的CD8+ T细胞数量显著增加，并主要集中在梗死周围区域。

细胞因子表达

通过流式细胞术分析发现，在术后第3天的脾脏中，CD8+ T细胞几乎不表达IFN-γ和IL-17A，而第30天脾脏中的CD8+ T细胞主要产生IFN-γ。术后第3天受伤侧大脑中的CD8+ T细胞也主要为IFN-γ产生细胞，而在术后第30天，受伤侧大脑中的CD8+ T细胞包括IFN-γ+ / IL-17A+双阳性细胞。

鉴定TC1和TC17细胞在受伤侧大脑中的存在

进一步的分析显示，TC1细胞在术后第3天受伤侧大脑中已经存在，而在第30天，IL-17A阳性的TC17细胞以及IFN-γ和IL-17A双阳性的TC17/1细胞也被检测到。

识别和富集活体TC1、TC17和TC17/1细胞

研究采用已知的化学因子/细胞因子受体标记，成功在术后第30天鉴定并分离了受伤侧大脑中的TC1、TC17和TC17/1细胞。TC1细胞被定义为CD8+ CCR6- CXCR3+细胞，TC17细胞为CD8+ CCR6hi CXCR3-/lo CCR4+ IL-23R+细胞，TC17/1细胞为CD8+ CCR6int CXCR3+CCR4+ IL-23R+细胞。

TC17/1细胞在微胶质细胞中诱导炎症反应最强

共培养实验显示，所有三种CD8+ T细胞亚群都能激活微胶质细胞并诱导炎症介质的表达，其中TC17/1细胞的诱导效应最强。

研究结论

本研究首次揭示了CD8+ T细胞亚群（包括TC1、TC17和TC17/1细胞）在卒中后长期神经炎症中的潜在作用。这些细胞亚群特别是TC17/1细胞通过激活微胶质细胞，可能在卒中后的慢性神经炎症中起到重要作用，因此可能成为未来卒中治疗的新靶点。

研究亮点

1. 首次发现：首次报道了TC1、TC17和TC17/1细胞在卒中后大脑中的长期存在和作用。
2. 细胞识别：成功识别和富集了活体的TC1、TC17和TC17/1细胞，并验证了其标志物表达。
3. 功能验证：通过共培养实验验证了这些细胞亚群在激活微胶质细胞并诱导炎症反应中的不同作用，发现TC17/1细胞具有最强的诱导效应。

本研究加深了对卒中后长时间神经炎症过程的理解，并提示了新的治疗途径。未来的研究还需进一步探索这些细胞亚群的来源、动态变化及其对其他神经细胞和功能恢复的影响。