Détection de l’activité de germination des agrégats de SOD1 humain dans les tissus neuronaux post-mortem de patients atteints de sclérose latérale amyotrophique familiale et sporadique

Introduction

La sclérose latérale amyotrophique (ALS) est une maladie neurodégénérative à progression rapide, avec une espérance de vie moyenne de 2 à 5 ans après le diagnostic. Les symptômes principaux incluent des fasciculations musculaires, de la fatigue musculaire, des crampes et une faiblesse musculaire. Les symptômes avancés incluent la perte de poids, l’aphasie et la paralysie, et l’insuffisance respiratoire est la principale cause de mortalité. Les causes de l’ALS sont complexes : environ 90 % des cas d’ALS sont sporadiques (sALS), les 10 % restants étant héréditaires (fALS). Des études antérieures ont montré que des agrégats de la superoxyde dismutase 1 humaine (SOD1), une métalloprotéine, apparaissent dans les tissus neuronaux des patients atteints d’ALS, notamment chez ceux ayant des mutations du gène SOD1. De plus, des agrégats de SOD1 ont été détectés dans d’autres formes d’ALS, y compris celles associées à l’expansion anormale du gène C9ORF72, la cause la plus fréquente de fALS, ainsi que dans les cas sporadiques.

Les recherches actuelles indiquent que les agrégats de SOD1 pourraient posséder des propriétés de propagation de type prion. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles méthodes diagnostiques pour mieux comprendre les dynamiques de SOD1 dans la pathologie de l’ALS et évaluer son potentiel en tant que biomarqueur de l’ALS. Cette étude vise à développer une méthode de détection de germination basée sur la conversion induite par oscillation en temps réel (RT-QuIC) pour mesurer l’activité des germes de SOD1 dans les tissus de la moelle épinière et le cortex moteur post-mortem de patients ALS.

Source de l’article et informations sur les auteurs

Cette étude a été rédigée par Justin K. Mielke, Mikael Klingeborn, Eric P. Schultz, Erin L. Markham, Emily D. Reese, Parvez Alam, Ian R. Mackenzie, Cindy V. Ly, Byron Caughey et Neil R. Cashman. Les institutions impliquées incluent le McLaughlin Research Institute, l’University of Montana, les Rocky Mountain Laboratories, l’University of British Columbia et la Washington University. L’article a été publié dans l’édition 147 de la revue Acta Neuropathologica, page 100, en 2024. Il a été soumis le 1er février 2024, révisé le 6 juin 2024 et accepté pour publication le 7 juin 2024.

Méthodologie

Processus de travail

L’étude s’est déroulée en plusieurs étapes principales :

1. Préparation et purification des plasmides contenant le gène SOD1 humain : L’équipe de recherche a construit et exprimé des plasmides contenant le gène complet de SOD1 humain dans la souche E. coli BL21 (DE3), puis purifié la protéine par affinité métalliques pour vérifier la qualité de SOD1 exprimé.

2. Préparation et traitement des tissus post-mortem de la moelle épinière et du cortex moteur humain : Des tissus comprenant la moelle épinière cervicale et thoracique ainsi que le cortex moteur ont été extraits de patients ALS et de contrôles sains pour préparer des homogénats de différents gradients de concentration.

3. Expérimentation d’immunocapture : L’utilisation d’anticorps spécifiques à SOD1 couplés à des billes magnétiques a permis de capturer les agrégats de SOD1 pour contrôler la spécificité des tests RT-QuIC.

4. Tests SOD1 RT-QuIC : Une nouvelle méthode de RT-QuIC pour détecter SOD1 a été développée, utilisant un système de réaction optimisé composé d’ingrédients clés (comme le substrat SOD1, GuHCl, acétate de sodium et ThT). Les tests ont été réalisés sur des plaques à micropuits, et l’intensité de fluorescence a été mesurée pour suivre la progression de l’agrégation.

5. Analyse par microscopie électronique à transmission : Pour confirmer que les agrégats générés par RT-QuIC étaient des fibres amyloïdes, l’équipe de recherche les a examinés au microscope électronique à transmission.

6. Analyse des données et statistiques : En ajustant les courbes RT-QuIC, les valeurs d’augmentation de fluorescence et des périodes de latence ont été calculées pour analyser les différences entre les différents types de cas d’ALS.

Échantillons et sujets de l’expérience

1. Moelles épinières thoraciques et cortex moteur des patients sALS et des contrôles sains fournis par le National Institutes of Health (NIH).
2. Échantillons de moelle épinière de fALS fournis par la National Brain Bank (Georgetown Brain Bank).
3. Autres échantillons neurologiques de contrôles fournis par l’équipe de Ian Mackenzie et Cindy Ly de l’UBC, ainsi que par d’autres équipes de la Washington University.
4. Données obtenues de plusieurs laboratoires, mises à l’épreuve par de nombreuses expériences répétées et contrôles pour garantir la fiabilité et la précision des données.

Résultats de l’étude

Caractéristiques de détection du substrat SOD1

Grâce au système de réaction RT-QuIC pour SOD1, l’étude a révélé que les agrégats de SOD1 peuvent induire une augmentation significative de l’intensité de fluorescence, particulièrement dans les tissus des patients ALS, contrairement aux contrôles sains. Cela suggère que ces agrégats de SOD1 possèdent des propriétés de réplication et de propagation.

Résultats des tests RT-QuIC chez différents types de patients ALS

1. ALS Familial (mutations SOD1) : Les tests RT-QuIC ont détecté une grande quantité d’agrégats de SOD1 dans les tissus de la moelle épinière et du cortex moteur de ces patients, avec des périodes de latence courtes et des intensités de fluorescence élevées.
2. ALS Familial (mutations C9ORF72) : Des agrégats de SOD1 ont également été détectés, montrant des propriétés de propagation similaires à celles des patients avec des mutations SOD1.
3. ALS Sporadique : Des agrégats de SOD1 ont été détectés dans les tissus des patients sALS, suggérant que le SOD1 wt peut également se propager de manière prion-like chez ces patients.

Activité des germes de SOD1 selon différentes régions anatomiques

En comparant les tissus de différents sites anatomiques (comme la moelle épinière thoracique et le cortex moteur) de patients ALS, l’étude a montré que l’activité des germes de SOD1 était significativement plus élevée dans le cortex moteur que dans la moelle épinière, suggérant que le taux de dégénérescence neuronale dans l’ALS pourrait être étroitement lié à la localisation anatomique.

Conclusions et implications

Cette étude a développé et validé une méthode de détection de l’activité des germes de SOD1 basée sur RT-QuIC, capable de détecter avec précision les agrégats de SOD1 dans les tissus neuronaux de divers types de patients ALS. Cette méthode montre un potentiel en tant que biomarqueur pour l’ALS, particulièrement important pour le diagnostic et la recherche sur les patients sALS. Avec des améliorations et une application continue, cette méthode pourrait offrir de nouveaux outils pour le diagnostic précoce et l’évaluation de l’efficacité des traitements de l’ALS.

Points saillants de l’étude

1. Développement de nouvelles méthodes : L’étude a développé la première méthode de détection de l’activité des germes de SOD1 associé à l’ALS basée sur RT-QuIC, avec une sensibilité et une spécificité élevées.
2. Détection de multiples types d’ALS : La méthode a été validée pour différentes formes pathologiques d’ALS, fournissant de nouvelles preuves sur les mécanismes pathologiques de divers types d’ALS.
3. Différences d’anatomie spécifiques : La découverte de différences significatives dans l’activité des germes de SOD1 entre les différentes régions anatomiques des tissus ALS fournit une nouvelle perspective pour la recherche sur les mécanismes de propagation de la pathologie.

Perspectives futures

À partir de cette étude, les prochaines étapes consisteront à explorer le potentiel d’application de cette méthode dans des échantillons biologiques obtenus de patients vivants et à continuer à étudier les similarités et les différences entre différents types d’ALS. Cela permettra de mieux comprendre les mécanismes de cette maladie complexe et de développer des stratégies thérapeutiques ciblées.