Caractérisation des vésicules extracellulaires d’origine tissulaire spinale dans l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale

Introduction

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie chronique démyélinisante du système nerveux central (SNC), dont l’étiologie et les méthodes de prédiction de la progression de la maladie font actuellement l’objet de recherches. L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est un modèle murin de la SEP, dans lequel les cellules T réactives à la myéline, activées par adjuvant, attaquent les cellules oligodendrogliales, provoquant une neuro-inflammation de la moelle épinière et de la partie antérieure du nerf optique.

Les vésicules extracellulaires (EVs) sont des particules membraneuses libérées par toutes les cellules et peuvent traverser bidirectionnellement la barrière hémato-encéphalique. Les EVs ont de multiples fonctions dans les états de santé et de maladie, telles que la communication intercellulaire, le transport de substances et la régulation immunitaire. Par conséquent, les EVs ont suscité un grand intérêt dans la recherche sur la SEP et l’EAE, étant considérées comme des biomarqueurs plasmatiques potentiels et des vecteurs thérapeutiques. Cependant, on sait peu de choses sur les changements des EVs liés à la maladie dans le SNC. Pour combler cette lacune, nous avons analysé les changements physiques et protéomiques des EVs d’origine spinale de souris à différents moments : avant l’induction de l’EAE, ainsi qu’au 16e et au 25e jour après l’induction.

Matériels et méthodes

Pour cette étude, des souris femelles C57BL/6J ont été utilisées, et le modèle EAE a été induit par immunisation avec le peptide MOG33-55 en adjuvant. Au 16e jour (phase aiguë de l’EAE) et au 25e jour (phase chronique de l’EAE), le tissu spinales des souris a été isolé et collecté, et les EVs ont été purifiées par chromatographie d’exclusion stérique (SEC) combinée avec l’ultracentrifugation. Les caractéristiques physiques des EVs ont été déterminées par une analyse de nanotracking des particules (NTA) et la microscopie électronique à transmission (TEM). Les protéomes des EVs à différents moments de l’EAE ont été analysés en utilisant la spectrométrie de masse TMT 18-plex, et divers outils bioinformatiques ont été utilisés pour l’analyse ultérieure.

Résultats

Propriétés physiques des EVs

Les analyses NTA et TEM ont montré qu’en comparaison avec les souris normales, il n’y avait pas de différences significatives dans la concentration des particules, la distribution de la taille ou la morphologie des EVs d’origine spinale chez les souris EAE. L’analyse par spectrométrie de masse a révélé l’accumulation de protéines marqueurs connus d’EVs (tels que CD81, CD9, CD63, etc.) dans les EVs, tandis que les protéines nucléaires, cytoplasmiques et la plupart des protéines mitochondriales étaient dégradées, ce qui indique que les particules isolées étaient bien des EVs.

Changements dans le protéome des EVs

Au total, 7010 protéines ont été identifiées, dont 2823 ont montré une expression différentielle à n’importe quel moment de l’EAE. Une analyse en composantes principales a révélé que les échantillons d’EVs des souris normales, et celles dans les phases aiguë et chronique de l’EAE pouvaient être séparés en trois groupes distincts, indiquant que le protéome des EVs subit des changements dynamiques au cours de l’évolution de la maladie.

Par rapport au contrôle normal, les protéines les plus significativement régulées dans les EVs pendant la phase aiguë de l’EAE étaient associées à la réponse inflammatoire, incluant des protéines liées à la présentation de l’antigène (comme H2-D1, etc.), les GTPases immunitaires (comme IIGP1, etc.), les protéines de la cascade du complément (C3, etc.), et les récepteurs de type Toll. Les protéines régulées à la baisse comprenaient les protéines de la myéline, les protéines associées à la formation des microfilaments et les marqueurs astrocytaires tels que BTBD17, etc. Les tendances de changement des EVs en phase chronique étaient similaires à celles de la phase aiguë, mais d’un degré moindre.

L’analyse d’enrichissement de l’ontologie génique (GO) a révélé que, à deux moments dans l’EAE, les voies liées à la réponse immunitaire étaient significativement régulées à la hausse, tandis que les voies liées à la synthèse de l’ATP, à la modulation des neurotransmetteurs et au recyclage des vésicules neurotransmettrices étaient régulées à la baisse. L’analyse par modèle linéaire a en outre montré que, par rapport au contrôle normal, les protéines associées à la réponse immunitaire, la cascade du complément, la cascade de coagulation et la phagocytose par les macrophages étaient régulées à la hausse dans les EVs pendant la phase aiguë de l’EAE, tandis que les protéines associées à la synthèse de l’ATP et aux fonctions neuronales étaient régulées à la baisse.

Origine des EVs en termes de cellules immunitaires

Les analyses prédicatives bioinformatiques ont montré que les types de cellules immunitaires contribuant aux EVs à partir de la moelle épinière des souris EAE ont subi des changements dynamiques. Après l’induction de l’EAE, les contributions relatives des cellules T, cellules NK, cellules dendritiques, monocytes/macrophages et neutrophiles dans les EVs ont toutes augmenté. De plus, les cellules T régulatrices dans les EVs ont diminué durant le processus EAE, tandis que les cellules T mémoires CD4 activées ont significativement augmenté au cours de la phase chronique. En outre, les protéines marquantes des macrophages promouvant l’inflammation ont été régulées à la hausse dans la phase aiguë et à la baisse dans la phase chronique, tandis que celles reflétant les macrophages activés alternativement étaient régulées à la hausse dans la phase chronique.

Changements dans les protéines myéliniques et neuronales

Durant le processus d’EAE, les niveaux des protéines myéliniques importantes telles que MBP et PLP dans les EVs ont diminué, reflétant la perte des oligodendrocytes. Cependant, les protéines myéliniques du système nerveux périphérique telles que MPZ et PMP2 ainsi que celles impliquées dans la régulation de la gaine nerveuse comme PRX, MPP6, NAALAD2, etc., étaient régulées à la hausse dans la phase chronique, ce qui pourrait refléter le déplacement temporaire des cellules de Schwann vers des zones démyélinisées et le processus de réparation de la remyélinisation.

Les analyses bioinformatiques ont prédit que les contributions des protéines issues des astrocytes, des microglies et des neurones matures dans les EVs diminuaient, tandis que les contributions issues des cellules souches des microglies et des microglies non matures augmentaient. Des analyses de validation ont en outre montré que les protéines marqueurs associées à la microglie en état stable (telles que TMEM119, P2RY12) étaient régulées à la baisse dans l’EAE, tandis que les marqueurs des microglies liés à l’inflammation étaient régulés à la hausse, reflétant le changement des microglies vers un phénotype pro-inflammatoire.

Corrélativement aux changements dans la myélinisation, les protéines liées à la maturation neurale et aux voies synaptiques dans les EVs étaient également régulées à la baisse avec la progression de l’EAE, en particulier les protéines associées aux synapses inhibitrices étaient plus significativement régulées à la baisse par rapport aux protéines synaptiques excitatrices. Des analyses supplémentaires ont montré que les protéines présynaptiques dans les EVs étaient régulées à la baisse de manière plus marquée que les protéines postsynaptiques.

Corrélation avec les biomarqueurs EVs plasmatiques dans la SEP

Des études antérieures ont identifié certains biomarqueurs inflammatoires potentiels dans les EVs plasmatiques des patients atteints de SEP. Il est intéressant de noter que dans cette étude, nous avons également observé que de nombreux biomarqueurs similaires étaient présents et modifiés dans les EVs spinales des souris EAE, tels que les protéines du complément, les protéines associées aux cellules T (CD4, etc.), les protéines de la cascade de coagulation (fibrinogène, etc.), ainsi que les récepteurs de type Toll et leurs co-récepteurs, ce qui soutient davantage le rôle pathologique commun des EVs dans l’EAE et la SEP.

Discussion

Cette étude a caractérisé de manière systématique les changements dans les caractéristiques physiques et la composition protéique des EVs dérivées de la moelle épinière des souris EAE, offrant de nouveaux aperçus sur le rôle des EVs dans le modèle de la SEP. Nous avons découvert que le protéome des EVs subissait des changements dynamiques au cours du processus d’EAE, reflétant des processus pathologiques clés dans le SNC tels que l’inflammation locale, la dé/remyélinisation et la pathologie synaptique, et suggérant que les EVs pourraient participer à la régulation de ces processus. En outre, nous avons également observé que certains biomarqueurs EVs inflammatoires précédemment identifiés dans le plasma de patients SEP étaient également modifiés dans les EVs spinales de souris EAE, indiquant une pathologie commune des EVs dans l’EAE et la SEP et suggérant que les changements dans le protéome des EVs pourraient avoir des similitudes entre le SNC et la circulation périphérique.

Cette étude fournit de nouveaux indices sur le rôle des EVs dans les mécanismes de la maladie SEP/EAE et jette les bases pour des études futures sur les biomarqueurs liés aux EVs et les traitements ciblés. Il convient de noter que l’isolement, la purification et l’analyse des EVs continuent de représenter des défis techniques, et des études ultérieures devront explorer des méthodes d’analyse plus précises. De plus, il sera nécessaire dans de futures recherches d’explorer davantage la signification fonctionnelle des EVs dérivés de cellules spécifiques.