Rapport de recherche : Le β-hydroxybutyrate améliore l’état redox, la sécrétion de cytokines et la capacité de phagocytose des cellules microgliales humaines HMC3 privées de glucose

Introduction

Les cellules microgliales sont les cellules neuro-immunitaires résidentes du cerveau, représentant 5 à 12% du total des cellules gliales, avec une forte capacité de migration, de prolifération et de phagocytose. Par exemple, les cellules microgliales maintiennent un microenvironnement cérébral sain en phagocytant les débris cellulaires apoptotiques dans le parenchyme cérébral. En cas d’infection ou de lésion du système nerveux central, les cellules microgliales migrent vers le site de la lésion, phagocytent les agents pathogènes envahissants ou les débris de cellules mortes, et aident à la récupération des tissus endommagés en libérant des cytokines inflammatoires, des chimiokines et des facteurs de croissance. Bien que les cellules microgliales présentent une diversité fonctionnelle complexe, on ne sait pas clairement comment l’altération du métabolisme du glucose affecte leurs fonctions. Les troubles du métabolisme du glucose sont courants dans presque toutes les maladies neurodégénératives et psychiatriques, telles que l’accident vasculaire cérébral, la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer, les troubles liés à l’usage de substances, l’anxiété et la dépression. L’hypoglycémie se produit également temporairement chez les patients diabétiques recevant un traitement à l’insuline. Comprendre l’impact de la privation de glucose sur la fonction des cellules microgliales est important pour l’étude des mécanismes et le traitement de ces maladies.

Source de l’article

Cet article a été rédigé par Anil Kumar Rana, Babita Bhatt et Mohit Kumar, entre autres, du National Agri-Food Biotechnology Institute et du Regional Centre for Biotechnology. Il a été publié dans le Journal of Neuroimmune Pharmacology en 2024. Le DOI est 10.1007/s11481-024-10139-5.

Flux de travail de la recherche

Cette étude a examiné les changements dans l’état phénotypique, l’état redox, la sécrétion de cytokines et la capacité de phagocytose de la lignée cellulaire microgliale humaine HMC3 cultivée in vitro dans des conditions de privation de glucose. De plus, l’étude a exploré l’effet restaurateur du β-hydroxybutyrate (BHB) comme supplément métabolique sur ces caractéristiques.

Conception et méthodes expérimentales

1. Culture cellulaire et traitement :

   • Les cellules HMC3 ont été cultivées dans du DMEM à haute teneur en glucose (25mM), supplémenté avec 10% (v/v) de sérum fœtal bovin (FBS) et 1% (v/v) d’antibiotiques pénicilline et streptomycine.
   • À 80-90% de confluence, les cellules ont été remplacées par du DMEM frais à haute teneur en glucose pendant 24 heures. Pour les expériences de privation de glucose et de supplémentation en BHB, les cellules ont été cultivées pendant 24 heures dans du DMEM sans glucose et du DMEM sans glucose supplémenté avec 5mM de BHB.

2. Test MTT :

   • La réduction du MTT dépend des oxydoréductases dépendantes du NAD(P)H et est un indicateur direct de l’activité de la phosphorylation oxydative et de la voie des pentoses phosphates. L’expérience a vérifié l’effet de la privation de glucose sur l’activité métabolique cellulaire en détectant le niveau de phosphorylation oxydative des cellules.

3. Détermination du niveau de nitrite :

   • Le réactif de Griess a été utilisé pour détecter les niveaux de nitrite dans les cellules dans différentes conditions, afin d’évaluer l’état redox des cellules.

4. Test de mort cellulaire :

   • La méthode de coloration au bleu de trypan a été utilisée pour étudier la mort cellulaire. Le colorant bleu de trypan ne peut pas traverser les membranes cellulaires intactes et est repoussé par les colorants chargés négativement, mais peut pénétrer dans les cellules mortes endommagées.

5. Niveaux de superoxyde :

   • Le colorant dihydroéthidium (DHE) a été utilisé pour détecter les niveaux de superoxyde dans les cellules exposées à différentes conditions, évaluant ainsi l’état de résistance au stress oxydatif des cellules.

6. Coloration mitochondriale :

   • Le colorant MitoTracker™ rouge a été utilisé pour évaluer l’état de santé mitochondrial des cellules.

7. PCR quantitative :

   • La PCR quantitative par transcription inverse (qPCR) a été utilisée pour analyser l’expression de l’ARNm des gènes.

8. Test ELISA :

   • Utilisé pour la détection quantitative des niveaux de cytokines telles que TNF, IL-1β, IL-6 et IL-10 sécrétées par les cellules HMC3 dans des conditions normales et de privation de glucose.

9. Test de phagocytose :

   • Des billes de latex marquées par fluorescence ont été utilisées comme substrat de phagocytose pour évaluer la capacité phagocytaire des cellules dans différentes conditions de traitement.

10. Western Blot :

    • Utilisé pour détecter les niveaux d’expression des protéines Nox2, BDH1 et SCOT dans les cellules HMC3 dans des conditions normales et de privation de glucose.

Résultats de la recherche

1. Effet de la privation de glucose sur le métabolisme énergétique et l’état redox :

   • Les résultats du test MTT ont montré que la privation de glucose entraînait une réduction significative de l’activité métabolique des cellules HMC3 (p,0001), et l’état de santé mitochondrial était également altéré (diminution de la coloration Mitotracker). Bien qu’aucune mort cellulaire n’ait été observée (coloration au bleu de trypan), le métabolisme énergétique global et l’état redox étaient altérés.
   • L’expression de l’ARNm de Nox2 était augmentée dans les cellules en conditions de privation de glucose (p=0,007), mais le niveau protéique était diminué. De plus, les niveaux de superoxyde et de nitrite étaient significativement réduits, indiquant une capacité altérée de résistance au stress oxydatif des cellules en conditions de privation de glucose.

2. Effet de la privation de glucose sur la sécrétion de cytokines :

   • L’analyse qPCR a montré que l’expression de l’ARNm de l’IL-1β était augmentée (p=0,0009) dans des conditions de privation de glucose, tandis que l’expression de l’ARNm du TNF était significativement réduite (p=0,0009). L’expression de l’ARNm de l’IL-6 n’a pas montré de changement significatif.
   • Les résultats ELISA ont confirmé davantage que la sécrétion d’IL-1β et de TNF était réduite dans des conditions de privation de glucose, tandis que la sécrétion d’IL-6 et d’IL-10 ne montrait pas de changement significatif.

3. Effet de la privation de glucose sur la capacité de phagocytose :

   • L’analyse qPCR a révélé que l’expression de l’ARNm de TREM2 (p=0,016) et CD68 (p=0,0006) était significativement augmentée dans des conditions de privation de glucose. Cependant, les expériences de phagocytose fonctionnelle (billes de latex) ont montré que la privation de glucose réduisait significativement l’activité phagocytaire des cellules.

4. Effet restaurateur de la supplémentation en BHB :

   • La supplémentation en BHB a significativement restauré la sécrétion d’IL-1β (p=0,0328) et l’activité phagocytaire (p=0,0261) des cellules HMC3 privées de glucose.
   • Mécaniquement, la supplémentation en BHB a augmenté l’expression de la protéine BDH1 (p=0,0423), mais l’expression de SCOT n’a pas montré de changement significatif. De plus, la supplémentation en BHB a également amélioré la santé mitochondriale (augmentation significative du niveau de réduction du MTT, p,0001).

Conclusion

Cette étude démontre que les troubles du métabolisme du glucose peuvent affecter la phagocytose et la fonction neuro-immune des cellules microgliales, aggravant ainsi les changements pathologiques dans les maladies du système nerveux. La supplémentation en corps cétoniques (comme le BHB) peut servir de source d’énergie alternative, restaurant le métabolisme énergétique, l’état redox, la sécrétion de cytokines et la capacité de phagocytose des cellules microgliales dans des conditions de privation de glucose. Par conséquent, le BHB pourrait potentiellement être utilisé comme thérapie métabolique pour améliorer ces conditions pathologiques. À l’avenir, des recherches supplémentaires seront nécessaires pour valider ces découvertes dans des environnements in vivo plus complexes.

Points forts de la recherche

• Première étude approfondie de l’impact de la privation de glucose sur le métabolisme énergétique, l’état redox, la sécrétion de cytokines et la capacité de phagocytose des cellules microgliales humaines HMC3.
• Découverte que la privation de glucose réduit significativement l’activité métabolique et la capacité de résistance au stress oxydatif des cellules microgliales, tout en affaiblissant leur sécrétion de cytokines et leur fonction phagocytaire.
• Proposition de la supplémentation en BHB comme source d’énergie alternative capable de restaurer efficacement la fonction des cellules microgliales dans des conditions de privation de glucose.