SaCas9の優れた正確性とSpCas9に比べた異なる編集結果

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ゲノム編集 sacas9 spcas9 PAM配列 挿入効率 オフターゲット効果

高忠実度と異なる遺伝子編集結果のSaCas9とSpCas9の比較

研究背景

Cas9タンパク質に基づくCRISPRシステムは、ゲノム編集の強力なツールとなり、基礎研究や臨床遺伝子治療で広く応用されています。現在、最も一般的に使用されているCas9変異体は、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）由来のSpCas9と黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来のSaCas9です。これら2つのCas9タンパク質は多くの研究で広く検証されていますが、具体的な遺伝子編集効果の比較については、まだ系統的な研究が不足しています。そのため、本論文はSpCas9とSaCas9の遺伝子編集における効率と精度を系統的に比較し、異なる切断長での編集性能を探究することを目的としています。

研究ソース

本論文は、中国医学科学院血液学研究所などいくつかの研究機関の研究者によって執筆され、Zhi-Xue Yang、Ya-Wen Fu、Jian-Ping Zhangなどが含まれており、研究結果は2023年の「Genomics, Proteomics & Bioinformatics」誌に発表されました。

研究プロセス

研究プロセスは以下のステップに分けることができます：

  1. 研究デザインとゲノムターゲット配列の選択：

    • ChopChopツールを使用して、ヒトAAVS1、ALB、B2M1などの遺伝子をターゲットとするsgRNA配列を設計
    • Staphylococcus aureus Cas9（SaCas9）とStreptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）が同時に認識するPAM配列（NGGRRT）を決定

  2. 細胞培養と電気穿孔：

    • ヒト誘導多能性幹細胞（iPSCs）とK562白血病細胞を含む研究で、両細胞型を標準化された方法で培養し電気穿孔
    • Lonza 2bシステムを使用して電気穿孔を行い、Cas9-sgRNAプラスミドを細胞に導入

  3. 遺伝子編集効率の評価：

    • 1次および2次PCRによるターゲット配列の増幅後、Illuminaディープシークエンシングを実施
    • CRISPResso2ツールを使用して編集頻度、HDR効率、dsODN挿入率を分析

  4. 高スループットシークエンシングとデータ分析：

    • Guide-seq分析を利用して全ゲノム特異性検出を評価
    • Cas9誘導の二本鎖切断修復結果を精密に分析し、NHEJ、MMEJ、HDR修復メカニズムに焦点を当てる

研究結果

異なるスペーサー長でのSpCas9とSaCas9の編集効率

研究は以下を示しています：

  1. SpCas9の最適スペーサー長 は20 ntで、18、19、21 ntのスペーサー長が少数のケース（AAVS1cやB2M1など）でより高い活性を示しました。

  2. SaCas9はスペーサー長 の変化に対してより敏感で、最も効果的なスペーサー長は21-22 ntです。スペーサー長が23 ntに達すると、編集効率は著しく低下しました。

遺伝子編集結果と修復タイプの差異

  1. 挿入欠失頻度（Indel）：

    • iPSCsとK562細胞において、SaCas9は多くのターゲットサイトでより高いIndel頻度を示しました。

  2. NHEJ修復特性：

    • SaCas9はNHEJ修復下で+1挿入突然変異（特に+T）の頻度がSpCas9よりも約10倍低く、Staggered Cutによる突然変異を減少させました。これにより、DSODN挿入とHDR編集のためのより良い条件が提供されました。

  3. HDR効率と挿入効率：

    • 平均して、SaCas9は遺伝子挿入（例：DSODN）とHDR（例：AAV6-donor）の編集効率がSpCas9よりも著しく高くなりました。

オフターゲット効果

  • Guide-seq分析を通じて、SaCas9はiPSCsとK562細胞において総オフターゲットサイト数がSpCas9よりも著しく少なく、SaCas9がin vitro遺伝子編集でより高い特異性を持つことが示されました。22-ntスペーサーを使用したSaCas9編集は、より低いオフターゲット活性を示しました。

結論

本研究の結果は、遺伝子編集においてSaCas9がSpCas9と比較して多方面で優れていることを示しています。特にStaggered Cut選好性、NHEJ修復結果、オフターゲット効果の面で、SaCas9はより高い編集効率と精度を示しました。本研究は遺伝子編集、特に臨床遺伝子治療におけるツール選択と使用に重要な理論的サポートと応用ガイダンスを提供しています。

研究のハイライト

  • 著しく低いオフターゲット効果：Guide-seqを用いた高スループットシークエンス分析により、SaCas9システムがSpCas9と比較して遺伝子編集におけるオフターゲットリスクが著しく低いことが示されました。
  • 編集効率を向上させる方法：本研究では、NLSとHMGA2エレメントを使用して最適化されたCas9融合タンパク質を設計・検証し、遺伝子編集効率を著しく向上させました。
  • 詳細な実験設計と分析：本研究は、異なるスペーサー長でのCas9-sgRNAのノックアウト効率と修復メカニズムについて詳細な評価を行い、将来の遺伝子編集実験設計に重要な参考を提供しました。

研究の意義

本研究は、遺伝子編集におけるSpCas9とSaCas9の性能を系統的に比較し、精密遺伝子編集と遺伝子治療の発展に重要な意義を持ちます。SaCas9タンパク質は高度に特異的で、鈍端末端の生成を好むため、臨床遺伝子治療での応用においてより優位性があります。特に、オフターゲット効果に敏感な治療領域において有用です。