学術的背景と問題提起

ミトコンドリアは真核細胞において重要な細胞小器官であり、細胞のエネルギー代謝、シグナル伝達、細胞の生存と死の調節に関与しています。ミトコンドリアの機能障害は、神経変性疾患、心血管疾患、糖尿病、がんなど多くの人間の疾患と関連しています。そのため、ミトコンドリアの動態を研究することは、その生物学的機能と疾患における役割を理解する上で重要です。しかし、従来の電子顕微鏡（EM）は非常に高い空間分解能を持っていますが、固定されたサンプルにしか適用できず、ミトコンドリアの動態を捉えることはできません。蛍光顕微鏡は生体サンプルの観察に使用できますが、特に3次元（3D）再構築や長時間のイメージングにおいて、光退色（photobleaching）の問題が定量分析の精度を大きく低下させています。

光退色とは、蛍光分子が光照射によって不可逆的な化学変化を起こし、蛍光信号が徐々に弱まる現象です。この問題は長時間のイメージングにおいて特に顕著で、ミトコンドリアなどの細胞小器官の動態研究を制限しています。これまでに光退色の影響を補正するための様々な方法が提案されていますが、これらの方法は複雑なアルゴリズムや仮定に基づいており、人工的な誤差を導入する可能性があります。そのため、生体サンプルにおいて高解像度のイメージングを行い、光退色を効果的に克服する技術の開発が現在の研究における重要な課題となっています。

論文の出典と著者情報

本論文は、英国ロンドン大学（University College London）の細胞・発生生物学部門の研究チームによって行われ、主な著者にはSegos Ioannis、Van Eeckhoven Jens、Greig Alan、Redd Michael、Thrasivoulou Christopher、Conradt Barbaraが含まれます。この論文は2024年にnpj Imaging誌に掲載され、タイトルは《Impact of photobleaching on quantitative, spatio-temporal, super-resolution imaging of mitochondria in live C. elegans larvae》です。

研究の流れと実験方法

1. C. elegans幼虫の機械的固定

生体サンプルにおいて超解像度（super-resolution, SR）イメージングを行うために、研究チームはポリスチレンナノビーズ（polystyrene nanobeads）を使用した機械的固定法を開発しました。この方法は薬物を使用せず、C. elegans幼虫を固定し、イメージング中に静止させることができます。具体的な手順は以下の通りです：

1. サンプル準備：C. elegans幼虫を10%アガロースパッド上に配置し、カバーガラスで覆います。
2. 固定プロセス：ナノビーズの摩擦とカバーガラスの圧力を利用して、幼虫をアガロースパッド上に固定し、イメージング中の動きを防ぎます。
3. イメージング条件：幼虫の左側がカバーガラスに接触するようにし、ターゲット細胞（例：ql.p神経芽細胞）が超解像度イメージングできるようにします。

2. 超解像度タイムラプスイメージング

研究チームはZeiss LSM980顕微鏡のAiryscan SRモードを使用してイメージングを行い、単一のミトコンドリアの解像度を達成しました。具体的な手順は以下の通りです：

1. トランスジェニック株の構築：ミトコンドリアマトリックスマーカー（mtGFP）を発現するトランスジェニックC. elegans株を構築し、ミトコンドリアを標識しました。
2. イメージングパラメータ：63×油浸対物レンズを使用し、解像度は120 nm（xy）および360 nm（z）で、1分ごとに画像を取得しました。
3. 画像処理：多段階のタイムラプスイメージングを通じて、細胞分裂中のミトコンドリアの動態を捉えました。

3. 画像処理と3D再構築

ミトコンドリアの動態を定量分析するために、研究チームは以下の画像処理プロセスを開発しました：

1. 画像アライメント：幼虫がイメージング中にわずかに動くため、画像アライメント技術を使用してミトコンドリアの位置を補正しました。
2. 画像減算：蛍光信号の重なりを除去するために、mtGFP画像からmCherry信号を減算しました。
3. 画像トリミング：ターゲット細胞を含む領域をトリミングし、画像処理の計算量を削減しました。
4. デコンボリューション：Richardson-Lucyアルゴリズムを使用して画像をデコンボリューション処理し、解像度を向上させました。
5. 3Dレンダリング：Imarisソフトウェアを使用してミトコンドリアを3D再構築し、その体積、形態、分布を定量分析しました。

4. 光退色の影響分析

研究チームは多段階のタイムラプスイメージングを通じて、光退色がミトコンドリアの蛍光信号に与える影響を分析しました。その結果、光退色により蛍光信号が徐々に弱まるものの、グローバル閾値（global thresholding）に基づく画像セグメンテーション法は光退色の影響を受けず、ミトコンドリアの数を正確に定量化できることが示されました。

主な研究結果

1. 機械的固定の有効性：研究チームが開発した機械的固定法は、C. elegans幼虫を効果的に固定し、イメージング中に静止させることができ、正常な発育に影響を与えませんでした。
2. 超解像度イメージングの実現：Airyscan SRモードを使用して、研究チームは細胞分裂中のミトコンドリアの動態を捉え、単一のミトコンドリアの解像度を達成しました。
3. 画像処理プロセスの最適化：研究チームが開発した画像処理プロセスは、細胞の動きと蛍光信号の重なりを効果的に補正し、ミトコンドリアの3D再構築を実現しました。
4. 光退色の影響：光退色により蛍光信号が徐々に弱まるものの、グローバル閾値に基づく画像セグメンテーション法は光退色の影響を受けず、ミトコンドリアの数を正確に定量化できることが示されました。

研究の結論と意義

この研究では、生体サンプルにおいて超解像度イメージングを行い、光退色を効果的に克服する技術を開発しました。この技術は、ミトコンドリアなどの細胞小器官の動態を研究するための新しいツールを提供します。研究結果は、グローバル閾値に基づく画像セグメンテーション法が光退色の影響を受けず、ミトコンドリアの数を正確に定量化できることを示しており、蛍光顕微鏡の定量研究における応用を推進するものです。

研究のハイライト

1. 新しい機械的固定法：研究チームが開発したナノビーズを使用した機械的固定法は、薬物を使用せずにC. elegans幼虫を固定し、さまざまな生物学的研究に適用できます。
2. 超解像度イメージングの実現：Airyscan SRモードを使用して、研究チームは細胞分裂中のミトコンドリアの動態を捉え、単一のミトコンドリアの解像度を達成しました。
3. 光退色問題の解決：研究結果は、グローバル閾値に基づく画像セグメンテーション法が光退色の影響を受けず、ミトコンドリアの数を正確に定量化できることを示しており、蛍光顕微鏡の定量研究における応用を推進するものです。

その他の価値ある情報

研究チームは、異なる蛍光タンパク質（例：GFPとmKate2）が光退色下でどのように振る舞うかについても検討し、グローバル閾値に基づく画像セグメンテーション法がさまざまな蛍光タンパク質や細胞小器官マーカーに適用可能であることを示しました。さらに、研究チームは光退色下での画像ヒストグラム（image histogram）の変化パターンを提案し、新しい画像解析ツールの開発に理論的基盤を提供しました。

まとめ

この研究では、新しい機械的固定法と画像処理プロセスの最適化を通じて、生体サンプルにおいて超解像度イメージングを行い、光退色問題を効果的に克服する技術を開発しました。この技術は、ミトコンドリアなどの細胞小器官の動態を研究するための新しいツールを提供し、科学的および応用的な価値を持っています。