スプライソソームの忠実性に関する構造的洞察：DHX35–GPATCH1を介した異常スプライシング基質の拒絶

学術的背景紹介

スプライソソーム（spliceosome）は、高度に動的な巨大分子複合体であり、pre-mRNAからイントロン（intron）を正確に切除する役割を担っています。近年、クライオ電子顕微鏡（cryo-electron microscopy, cryo-EM）技術を通じて、科学者たちはスプライソソームの段階的な組み立て、触媒的スプライシング、そして最終的な解離過程についてかなり詳細な構造的理解を得てきました。しかし、スプライソソームがどのようにして最適でないスプライシング基質を認識し、拒絶するのかという分子メカニズムはまだ不明です。この問題は、スプライシングの忠実性（splicing fidelity）を理解する上で極めて重要です。なぜなら、スプライシングのエラーは遺伝子発現の異常を引き起こし、さまざまな疾患の原因となる可能性があるからです。

本研究は、特定のRNAヘリカーゼ（helicase）とG-patchタンパク質（G-patch protein）が、異常なスプライシング基質、特に非典型的な5’スプライスサイト（5’ splice site, 5’SS）を含むpre-mRNAをどのように認識し、拒絶するかを明らかにすることを目的としています。好熱性真核生物Chaetomium thermophilumのスプライソソーム品質管理複合体を研究することで、著者らはDHX35–GPATCH1複合体がスプライソソームの忠実性において果たす重要な役割を高解像度のクライオ電子顕微鏡構造を通じて明らかにしました。

論文の出典

この論文は、Yi Li、Paulina Fischer、Mengjiao Wangら、Fudan University、Heidelberg University Biochemistry Center (BZH)、Max-Planck-Institute for Multidisciplinary Sciencesなど複数の研究機関からなる研究チームによって共同で執筆され、2025年にCell Research誌に掲載されました。論文のタイトルは“Structural insights into spliceosome fidelity: DHX35–GPATCH1-mediated rejection of aberrant splicing substrates”です。

研究の流れと結果

1. 研究の流れ

a) スプライソソームの分離と精製

研究チームはまず、Chaetomium thermophilumからスプライソソーム複合体を分離しました。保守的な解離因子DHX15をベイト（bait）として使用し、タンデムアフィニティ精製（tandem-affinity purification）技術を用いることで、複数のスプライソソームコアタンパク質および既知の解離因子を精製することに成功しました。質量分析（mass spectrometry）により、DHX15と共に沈殿したスプライソソームタンパク質、例えばU2 snRNPやU5 snRNPなどが確認されました。

b) クライオ電子顕微鏡データの収集と処理

研究チームはクライオ電子顕微鏡データを収集し、自動粒子選別（particle picking）と3次元分類（3D classification）技術を用いて、最終的に3つの主要なスプライソソーム複合体を解析しました。これらは、ILS複合体（intron-lariat spliceosome）と2つの品質管理複合体B*Q1およびB*Q2です。これらの複合体は、スプライソソームが触媒的に活性化された後、最初のスプライシング反応の前に捕捉された状態を表しています。

c) 構造モデリングと解析

AlphaFoldで予測されたタンパク質構造とクライオ電子顕微鏡密度マップを組み合わせることで、研究チームはスプライソソームの分子モデルを構築しました。特に、DHX35–GPATCH1複合体がスプライソソームとどのように相互作用するかを詳細に解析し、GPATCH1がそのG-patchドメイン（G-patch domain）を通じて異常な5’SSを認識し、DHX35をスプライソソームに固定する仕組みを明らかにしました。

2. 主な結果

a) DHX35–GPATCH1複合体の構造

研究結果によると、GPATCH1はそのN末端領域を介してスプライソソームのコアタンパク質PRP8の複数のドメイン（EN、RH、α-fingerドメインを含む）と相互作用し、DHX35をスプライソソームに固定します。GPATCH1のG-patchドメインは、DHX35のWHおよびRecA2ドメインに結合し、DHX35のRNAヘリカーゼ活性を保証します。さらに、GPATCH1はU2 snRNAとの相互作用を通じて、DHX35がその基質に結合するのを導きます。

b) DHX35のヘリカーゼメカニズム

B*Q複合体では、DHX35はU2 snRNAの一本鎖領域に結合し、U2/分岐点（branch site, BS）ヘリックスを解離させます。このプロセスにより、スプライソソームのさらなる触媒反応が阻止され、異常なスプライシング基質の拒絶が保証されます。DHX35のヘリカーゼ活性は、GPATCH1の活性化に依存しており、GPATCH1はそのG-patchドメインを通じてDHX35のATPase活性を増強します。

c) DHX15の解離作用

B*Q2複合体では、DHX15はILS複合体と類似した結合部位にリクルートされ、その基質であるU6 snRNAの3’末端に近接しています。この結果は、DHX15がスプライソソームの解離過程において重要な役割を果たし、U6 snRNAを解離させることでスプライソソームの最終的な解離を促進する可能性を示唆しています。

3. 研究の結論

本研究は、高解像度のクライオ電子顕微鏡構造を通じて、DHX35–GPATCH1複合体がスプライソソームの忠実性において果たす重要な役割を明らかにしました。GPATCH1は、異常な5’SSを認識し、DHX35をスプライソソームに固定することで、異常なスプライシング基質の拒絶を保証します。同時に、DHX15はスプライソソームの解離過程において重要な役割を果たし、U6 snRNAを解離させることでスプライソソームの最終的な解離を促進します。これらの発見は、スプライソソームの品質管理メカニズムに対する新たな構造的洞察を提供し、スプライシングエラーに関連する疾患のメカニズムを理解する上で重要な手がかりとなります。

4. 研究のハイライト

• 高解像度構造解析：クライオ電子顕微鏡技術を用いて、初めてDHX35–GPATCH1複合体とスプライソソームの高解像度構造を解析しました。
• スプライソソームの忠実性メカニズム：GPATCH1が異常な5’SSを認識し、DHX35をスプライソソームに固定することで、異常なスプライシング基質の拒絶を保証する仕組みを明らかにしました。
• 二つのヘリカーゼの協調作用：DHX35とDHX15がスプライソソームの品質管理において協調的に作用するメカニズムを提唱し、スプライソソームの解離過程に対する新たな洞察を提供しました。

5. その他の価値ある情報

本研究では、RNAシーケンシング（RNA sequencing）技術を用いて、DHX35とGPATCH1がスプライソソームの品質管理において果たす機能を検証しました。研究チームは、DHX35またはGPATCH1をノックダウンすると、最適でない5’SSを含むpre-mRNAのスプライシングイベントが増加することを発見し、これらがスプライシングの忠実性において重要な役割を果たすことをさらに支持しました。

まとめ

本研究は、高解像度のクライオ電子顕微鏡構造と機能実験を通じて、DHX35–GPATCH1複合体がスプライソソームの忠実性において果たす重要な役割を明らかにしました。これらの発見は、スプライソソームの品質管理メカニズムに対する新たな構造的洞察を提供するだけでなく、スプライシングエラーに関連する疾患の研究においても重要な手がかりとなります。