3DバイオプリンティングGelMA水ゲル中のCav3.3を介した軟骨内骨化研究

研究背景

骨の成長は複雑なプロセスであり、その中で成長板（Growth Plate, GP）は長骨の縦方向の成長に重要な役割を果たしています。成長板は軟骨内骨化（Endochondral Ossification, EO）プロセスを通じて骨の成熟を調節します。しかし、成長板の機能障害は成長遅延や骨形成不全を引き起こす可能性があります。成長板の研究は骨の成長や関連疾患の理解において重要ですが、その複雑な時空間的変化により、体内研究は制限されています。近年、三次元（3D）バイオプリンティング技術の発展により、成長板の生理的および病理的機能を体外で研究するための新しいモデルが提供されています。しかし、軟骨内骨化プロセスを模倣することは、骨オルガノイド研究における重要な課題の一つです。

本研究は、T型電位依存性カルシウムチャネル（T-type Voltage-Dependent Calcium Channel, T-VDCC）サブタイプであるCav3.3を調節し、軟骨細胞の肥大分化におけるその役割を探求し、3Dバイオプリンティングされたゼラチンメタクリロイル（Gelatin Methacryloyl, GelMA）水ゲルモデルを用いて軟骨内骨化プロセスを模倣することを目的としています。この研究は、骨の成長を理解するための新しい視点を提供するだけでなく、骨オルガノイドの構築に潜在的な技術的支援を提供します。

論文の出典

この研究は、Chongqing Key Laboratory of Precision Medicine in Joint Surgery, Center for Joint Surgery, Southwest Hospital, Army Medical University (Third Military Medical University)のZhi Wang、Xin Wang、Yang Huangら研究者によって共同で行われました。論文は2024年11月26日にBio-design and Manufacturing誌にオンライン掲載され、DOIは10.1007/s42242-024-00287-1です。

研究の流れと結果

1. 研究の流れ

a) 動物実験と軟骨細胞の分離

研究では、12匹のC57BL/6マウスと9匹のCacna1i遺伝子ノックアウトマウス（Cacna1i−/−）を使用し、異なる年齢（1、2、4、6ヶ月）で実験を行いました。ヘマトキシリン・エオシン（H&E）染色とサフラニンO/ファストグリーン染色を用いて成長板の成長を観察しました。結果、Cacna1i−/−マウスの成長板は4ヶ月齢で6ヶ月齢の野生型マウスと同様の加速した骨化現象を示し、Cav3.3が成長板の成熟プロセスにおいて負の調節作用を果たしていることが示されました。

b) 軟骨細胞の培養とCav3.3の干渉

研究では、マウスの大腿骨顆から原代軟骨細胞を分離し、ATDC5細胞株を使用して実験を行いました。shRNA技術を用いてCav3.3特異的にノックダウンしたATDC5細胞（shCav3.3）を構築し、免疫蛍光染色、定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）、およびウェスタンブロットによりCav3.3発現の低下を確認しました。結果、shCav3.3細胞ではCav3.3の発現が有意に減少し、細胞内カルシウムシグナル強度が有意に低下しました。

c) GelMA水ゲルの調製と3Dバイオプリンティング

研究では、5% GelMA水ゲルをバイオインクとして使用し、3Dバイオプリンティング技術を用いて5 mm × 5 mm × 1.5 mmの水ゲルスキャフォールドを構築しました。レオロジーテストにより、GelMA水ゲルは15°Cで良好なプリント適性を示しました。プリント後の水ゲルスキャフォールドは405 nm紫外線を10秒間照射して架橋され、細胞生存率は90%以上でした。走査型電子顕微鏡（SEM）により、水ゲルスキャフォールドが均一な孔隙構造を持ち、細胞の接着と増殖に適していることが確認されました。

d) 3D培養と肥大分化関連遺伝子発現の分析

研究では、shCav3.3細胞をGelMA水ゲルにロードして3D培養を行い、mRNAシーケンシングにより差異発現遺伝子（DEGs）を分析しました。結果、Cav3.3ノックダウン後、細胞外マトリックス（ECM）関連遺伝子および肥大分化関連遺伝子（ShhやTGF-βなど）が有意にアップレギュレートされました。ウェスタンブロットおよび免疫蛍光染色により、shCav3.3細胞では肥大軟骨細胞マーカー（Col-X、MMP-13、Runx-2など）の発現が有意に増加し、透明軟骨マーカー（Col-II、Sox-9、Acanなど）の発現が有意に減少することが確認されました。

e) 鉱化プロセスとアルカリホスファターゼ（ALP）活性の検出

研究では、アルシアンブルー染色およびアリザリンレッドS染色を用いてGelMA水ゲル中のECMの沈着を評価しました。結果、shCav3.3群ではカルシウム沈着が有意に増加し、透明軟骨マーカーの強度が有意に低下しました。さらに、ALP活性測定により、shCav3.3群のALP活性が時間とともに有意に増加し、Cav3.3が軟骨細胞の肥大分化および鉱化プロセスの調節において重要な役割を果たしていることが確認されました。

2. 主な結果

• Cav3.3の軟骨細胞における発現と機能：Cav3.3はT-VDCCサブタイプの中で軟骨細胞において最も高い発現を示し、そのノックダウンは細胞内カルシウムシグナル強度を有意に低下させ、軟骨細胞の肥大分化を加速させました。
• GelMA水ゲルのプリント適性と細胞適合性：5% GelMA水ゲルは15°Cで良好なプリント適性と細胞適合性を示し、3Dバイオプリンティングに適していました。
• 3D培養環境が肥大分化を促進：3D培養環境下では、Cav3.3ノックダウン細胞はより強い肥大分化傾向を示し、ECM関連遺伝子および肥大分化関連遺伝子が有意にアップレギュレートされました。
• 鉱化プロセスの模倣：shCav3.3をロードしたGelMA水ゲルは、軟骨内骨化プロセスにおける鉱化プロセスを成功裏に模倣し、将来の層状で秩序だった鉱化成長板オルガノイドの構築に機能的なバイオインクを提供しました。

3. 結論と意義

本研究は、Cav3.3が軟骨細胞の肥大分化において負の調節作用を果たすことを初めて実証し、3DバイオプリンティングされたGelMA水ゲルモデルを用いて軟骨内骨化プロセスを成功裏に模倣しました。この研究は、骨の成長メカニズムを理解するための新しい分子メカニズムを提供するだけでなく、骨オルガノイドの構築に潜在的な技術的支援を提供します。今後の研究では、Cav3.3が骨成長疾患における治療標的としての可能性をさらに探求し、より複雑な骨オルガノイドの構築を実現するために3Dバイオプリンティング技術を最適化することが期待されます。

4. 研究のハイライト

• 新しい研究視点：Cav3.3が軟骨細胞の肥大分化において負の調節作用を果たすことを初めて明らかにしました。
• 革新的な実験手法：3Dバイオプリンティング技術とGelMA水ゲルを組み合わせ、軟骨内骨化プロセスを成功裏に模倣しました。
• 潜在的な応用価値：骨オルガノイドの構築および骨成長疾患の研究に新しい技術プラットフォームを提供します。

まとめ

本研究は、Cav3.3の発現を調節することで、軟骨細胞の肥大分化におけるその重要な役割を明らかにし、3Dバイオプリンティング技術を用いて軟骨内骨化プロセスを成功裏に模倣しました。この研究は、骨の成長メカニズムの理解を深めるだけでなく、骨オルガノイドの構築および関連疾患の治療に新しい視点を提供します。