人工动态RNA结构集合引导的通用RNA适配体传感标签的理性设计
人工动态RNA结构集合引导的通用RNA适配体传感标签的理性设计
学术背景
RNA分子在自然和合成生物系统中扮演着多种角色，其功能强烈依赖于其动态和特定的三维结构。RNA的二级和三级结构，如发夹、伪结、多路连接等，是理解RNA功能的关键“构建模块”。然而，现有的RNA结构研究大多基于静态结构，而大多数RNA介导的过程涉及构象变化。因此，动态结构集合的描述能够捕捉RNA的进化保守模式，并有助于其扩展设计。近年来，荧光RNA适配体（fluorogenic RNA aptamer, FRAPT）在生物应用中取得了显著进展，但其设计缺乏对动态结构集合的深入理解，且缺乏通用的设计原则。为了克服这些限制，研究者们开发了一种人工动态RNA结构集合“SSPepper”，并基于此设计了一种通用的荧光RNA生物传感标签“SSPepper-Apt”，用于实时成像小分子代谢物和蛋白质，并在CRISPR介导的基因组成像和基因编辑中表现出优异的兼容性。
论文来源
该论文由Jianing Hou、Pei Guo、Junyan Wang、Da Han和Weihong Tan共同撰写，作者分别来自上海交通大学医学院分子医学研究所和中国科学院杭州医学研究所。论文于2024年12月20日发表在PNAS（Proceedings of the National Academy of Sciences）期刊上，题为《Artificial dynamic structure ensemble-guided rational design of a universal RNA aptamer–based sensing tag》。
研究流程
1. 人工动态RNA结构集合“SSPepper”的设计与开发
为了开发通用的FRAPT传感器，研究者选择了具有明确结构信息的荧光RNA适配体“Pepper”作为基础。通过引入基序突变，研究者创建了一个动态结构集合“SSPepper”，其能量景观设计为包含复杂的荧光构象。具体设计步骤如下：
- 建立正确的二级结构：根据Pepper-HBC复合物的高分辨率结构，建立了人工动态结构集合的二级结构。
- 调整环的稳定性：由于FRAPT（Pepper）中与荧光团结合的区域无法修改，研究者选择了代表性的基序（螺旋和顶端环）来调整荧光构象的比例。
- 引入滑动茎：通过修改滑动茎的长度，增强了其在各种活细胞成像应用中的适用性。
通过这些步骤，研究者将Pepper分解为三个区域：关键调控域（蓝色）、驱动元件（黄色）和未改变的序列（灰色）。关键调控域被假设为启动HBC结合位点的结构变化，而Pepper的非保守P1螺旋被重新设计为具有不同长度的滑动茎。
2. SSPepper-Apt的体外表征
为了验证SSPepper-Apt的可移植性、可扩展性和可组合性，研究者将各种目标结合RNA元件的核心序列无缝插入SSPepper-Apt中，包括茶碱适配体、GTP适配体、ATP适配体、鸟嘌呤核糖开关、SAM-III核糖开关、牛免疫缺陷病毒Tat肽靶向RNA和凝血酶适配体。通过一系列实验，研究者验证了SSPepper-Apt在不同目标下的性能，并发现其具有广泛的动态操作范围和优异的选择性。
3. SSPepper-Apt在活细胞中的应用
研究者进一步将SSPepper-Apt应用于活细胞中，成功监测了茶碱和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的动态变化，并可视化了肽和蛋白质的定位。此外，SSPepper-Apt在CRISPR-Cas9系统中表现出优异的兼容性，能够用于预测基因编辑效率。
主要结果
- SSPepper的设计与开发：通过引入滑动茎和调控环，研究者成功创建了一个动态结构集合“SSPepper”，其荧光构象的比例可以通过环的稳定性进行精细调节。
- SSPepper-Apt的体外表征：SSPepper-Apt在不同目标下表现出广泛的动态操作范围和优异的选择性，能够用于检测小分子代谢物、肽和蛋白质。
- SSPepper-Apt在活细胞中的应用：SSPepper-Apt成功监测了活细胞中茶碱和SAM的动态变化，并可视化了肽和蛋白质的定位。此外，SSPepper-Apt在CRISPR-Cas9系统中表现出优异的兼容性，能够用于预测基因编辑效率。
结论
通过开发人工动态RNA结构集合“SSPepper”，研究者成功设计了一种通用的荧光RNA生物传感标签“SSPepper-Apt”。该标签具有可扩展性、可移植性、可组合性和可靠性，能够用于实时成像小分子代谢物和蛋白质，并在CRISPR介导的基因组成像和基因编辑中表现出优异的兼容性。这一研究为功能性RNA系统的构建提供了通用方法，避免了繁琐的序列组合过程，扩展了合成生物学工具的应用范围。
研究亮点
- 动态结构集合的设计：通过引入滑动茎和调控环，研究者成功创建了一个动态结构集合“SSPepper”，其荧光构象的比例可以通过环的稳定性进行精细调节。
- 通用传感标签的开发：SSPepper-Apt具有广泛的动态操作范围和优异的选择性，能够用于检测小分子代谢物、肽和蛋白质。
- 活细胞成像与基因编辑：SSPepper-Apt成功监测了活细胞中茶碱和SAM的动态变化，并可视化了肽和蛋白质的定位。此外，SSPepper-Apt在CRISPR-Cas9系统中表现出优异的兼容性，能够用于预测基因编辑效率。
研究意义
该研究为功能性RNA系统的构建提供了通用方法，避免了繁琐的序列组合过程，扩展了合成生物学工具的应用范围。SSPepper-Apt不仅在基础研究中具有重要价值，还在生物医学应用中具有广泛的应用前景，如实时监测细胞内代谢物、蛋白质定位以及基因编辑效率的预测。