剪接体保真度的结构洞察：DHX35–GPATCH1介导的异常剪接底物排斥机制

学术背景介绍

剪接体（spliceosome）是一个高度动态的大分子复合物，负责从pre-mRNA中精确切除内含子（intron）。尽管近年来通过冷冻电镜（cryo-electron microscopy, cryo-EM）技术，科学家们已经对剪接体的逐步组装、催化剪接和最终解离过程有了较为全面的结构理解，但剪接体如何识别并拒绝次优剪接底物的分子机制仍不清楚。这一问题对于理解剪接保真性（splicing fidelity）至关重要，因为剪接错误可能导致基因表达异常，进而引发多种疾病。

本文的研究旨在揭示剪接体如何通过特定的RNA解旋酶（helicase）和G-patch蛋白（G-patch protein）来识别和拒绝异常的剪接底物，特别是那些含有非典型5’剪接位点（5’ splice site, 5’SS）的pre-mRNA。通过研究来自嗜热真核生物Chaetomium thermophilum的剪接体质量控制复合物，作者提供了高分辨率的冷冻电镜结构，揭示了DHX35–GPATCH1复合物在剪接体保真性中的关键作用。

论文来源

该论文由Yi Li、Paulina Fischer、Mengjiao Wang等来自Fudan University、Heidelberg University Biochemistry Center (BZH)、Max-Planck-Institute for Multidisciplinary Sciences等多个机构的科研团队合作完成，并于2025年发表在Cell Research期刊上，题为“Structural insights into spliceosome fidelity: DHX35–GPATCH1-mediated rejection of aberrant splicing substrates”。

研究流程与结果

1. 研究流程

a) 剪接体的分离与纯化

研究团队首先从Chaetomium thermophilum中分离了剪接体复合物。通过使用保守的解离因子DHX15作为诱饵（bait），研究人员利用串联亲和纯化（tandem-affinity purification）技术，成功纯化了多个剪接体核心蛋白和已知的解离因子。质谱分析（mass spectrometry）进一步确认了与DHX15共沉淀的剪接体蛋白，包括U2 snRNP、U5 snRNP等。

b) 冷冻电镜数据收集与处理

研究人员收集了冷冻电镜数据，并通过自动粒子挑选（particle picking）和三维分类（3D classification）技术，最终解析了三种主要的剪接体复合物：ILS复合物（intron-lariat spliceosome）和两种质量控制复合物B*Q1和B*Q2。这些复合物分别代表了剪接体在催化激活后但在第一步剪接反应前被拦截的状态。

c) 结构建模与分析

通过结合AlphaFold预测的蛋白质结构和冷冻电镜密度图，研究人员构建了剪接体的分子模型。特别是，他们详细解析了DHX35–GPATCH1复合物与剪接体的相互作用，并揭示了GPATCH1如何通过其G-patch结构域（G-patch domain）识别异常的5’SS，并将DHX35锚定在剪接体上。

2. 主要结果

a) DHX35–GPATCH1复合物的结构

研究结果显示，GPATCH1通过其N端区域与剪接体核心蛋白PRP8的多个结构域（包括EN、RH和α-finger结构域）相互作用，从而将DHX35锚定在剪接体上。GPATCH1的G-patch结构域与DHX35的WH和RecA2结构域结合，确保了DHX35的RNA解旋活性。此外，GPATCH1还通过与U2 snRNA的相互作用，引导DHX35结合到其底物上。

b) DHX35的解旋机制

在B*Q复合物中，DHX35结合到U2 snRNA的单链区域，并解离了U2/分支位点（branch site, BS）螺旋。这一过程阻止了剪接体的进一步催化反应，从而确保了异常剪接底物的拒绝。DHX35的解旋活性依赖于GPATCH1的激活，后者通过其G-patch结构域增强了DHX35的ATPase活性。

c) DHX15的解离作用

在B*Q2复合物中，DHX15被招募到与ILS复合物相似的结合位点，并靠近其底物U6 snRNA的3’端。这一结果表明，DHX15可能在剪接体解离过程中发挥关键作用，通过解旋U6 snRNA来促进剪接体的最终解离。

3. 研究结论

本研究通过高分辨率的冷冻电镜结构，揭示了DHX35–GPATCH1复合物在剪接体保真性中的关键作用。GPATCH1通过识别异常的5’SS，并将DHX35锚定在剪接体上，确保了异常剪接底物的拒绝。同时，DHX15在剪接体解离过程中发挥重要作用，通过解旋U6 snRNA来促进剪接体的最终解离。这些发现为剪接体质量控制机制提供了新的结构洞察，并为理解剪接错误相关的疾病机制提供了重要线索。

4. 研究亮点

• 高分辨率结构解析：通过冷冻电镜技术，首次解析了DHX35–GPATCH1复合物与剪接体的高分辨率结构。
• 剪接体保真性机制：揭示了GPATCH1如何通过识别异常的5’SS，并将DHX35锚定在剪接体上，确保异常剪接底物的拒绝。
• 双解旋酶协同作用：提出了DHX35和DHX15在剪接体质量控制中的协同作用机制，为剪接体解离过程提供了新的见解。

5. 其他有价值的信息

本研究还通过RNA测序（RNA sequencing）技术，验证了DHX35和GPATCH1在剪接体质量控制中的功能。研究人员发现，敲低DHX35或GPATCH1会导致含有次优5’SS的pre-mRNA剪接事件增加，进一步支持了它们在剪接保真性中的关键作用。

总结

本研究通过高分辨率的冷冻电镜结构和功能实验，揭示了DHX35–GPATCH1复合物在剪接体保真性中的关键作用。这些发现不仅为理解剪接体质量控制机制提供了新的结构洞察，还为剪接错误相关疾病的研究提供了重要线索。