将骨来源的细胞外基质整合到大孔隙微丝带支架中以加速骨再生

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骨再生 大孔隙支架 细胞外基质 组织工程 免疫调节

融入骨来源细胞外基质（Bone-Derived ECM）至大孔径微带支架加速骨再生研究报告

随着生物医学领域的不断进展，组织工程和再生医学在多种组织修复中的应用变得日益重要，然而，对于骨组织再生的研究仍面临诸多挑战。骨骼损伤与再生能力不足是现代医学亟待解决的问题，尤其是在老龄化和特定疾病导致骨再生能力显著下降的情况下（如骨骼缺陷和创伤）。Critical-Sized Bone Defects（临界尺寸骨缺损）是一类无法自行愈合的骨损伤，目前常用的治疗方式包括自体或异体骨移植。然而，这种治疗方式存在供体组织有限、供体部位疾病风险以及免疫原性等问题。因此，开发创新材料以模拟骨基质环境并促进骨再生成为一个重要的科学议题。

在以上背景下，本文聚焦于开发大孔径的微带支架（Macroporous Microribbon Scaffolds, 简称μRB），结合骨来源的细胞外基质（Bone-Derived ECM, 简称BECM）以加速骨组织的再生。由Stanford University School of Medicine的Cassandra Villicana, Ni Su, Andrew Yang等人完成，该文章发表于Advanced Healthcare Materials期刊，其研究表明，整合BECM与大孔径支架可显著提升骨组织修复效果并增强血管生成。

研究概述与目的

背景与问题陈述

组织来源细胞外基质（Tissue-Derived Extracellular Matrix, 简称TDECM）作为一种广泛应用的生物材料，其高度仿生的特性可以诱导体内再生免疫反应，当前被广泛用于软组织再生。然而，由于现有TDECM材料多为纳米孔结构（Nanoporous Structure），其渗透性与细胞浸润限制了其对硬组织（如骨组织）再生的应用潜力。相比之下，Macroporosity（大孔性）对于加速细胞浸润与骨形成至关重要。然而，目前缺乏将大孔径特性结合到ECM基水凝胶中的策略，特别是针对骨修复的应用。此外，纯BECM材料的性能尚不足以支持高效骨再生。

因此，本研究旨在通过全新共旋制备技术（Co-Spinning Technique）将骨来源的细胞外基质与明胶基微带支架结合，并优化其材料组成，以实现更加高效的骨再生效应。

研究流程

研究分为以下几部分推进：

1. BECM的分离与特性分析

研究首先按照现有去细胞化协议对小牛胫骨（Bovine Tibiae）中的松质骨进行处理，包括去矿化、脂质提取和去细胞化，最终获得去细胞骨基质（BECM）。
- 主要确认的成分：利用Picogreen DNA Assay对细胞核残余进行量化分析，并经过血液学与组织学染色（H&E）。BECM的主要蛋白成分为胶原蛋白（Collagen），以及其他非胶原蛋白和细胞外基质调节因子。
- 通过质谱（Mass Spectrometry）分析，确认了BECM中的主要生物学功能蛋白能增强软骨内成骨（Endochondral Bone Morphogenesis），使其在骨再生中具有巨大的潜力。

2. BECM与μRB支架的结合与特性优化

利用基于湿法纺丝的共旋技术（Adapted Co-Spinning Method），将不同重量比例的BECM（0%、15%、25%、50%）与甲基丙烯酸明胶（GelMA）溶液混合后制备成微带结构，再组装成三维大孔支架。
- 支架形貌与BECM分布：利用共聚焦显微镜（Confocal Imaging）及扫描电镜（SEM）进行形貌成像，发现BECM分布均匀，15%-25%组内的BECM结合效果最佳。孔隙率量化显示支架在添加25% BECM以下时，其大孔性未受影响（≈20%孔隙率）。
- 机械与物理性能测试：进一步的力学分析表明，BECM在25%比例以下不会显著改变支架模量（Stiffness），但在50%时，模量显著降低，支架的稳定性减弱。

3. 体外性能测试：MSC成骨能力分析

为了验证BECM对成骨的促进作用，实验将小鼠间充质干细胞（MSC）包埋于支架中并进行为期4周的培养。 - 早期与晚期成骨指标：早期成骨关键标志物RUNX2的免疫荧光标记显示15%组BECM能显著上调其表达，而矿化水平的阿利新蓝染色（ARS Staining）也证实15%组的骨化效果优于其他组别。 - 主成骨细胞基质增加：Masson Trichrome染色表明15%组BECM支架在细胞外基质沉积和成骨细胞生成方面施展了最佳促进效应。

4. 增强体外成骨能力：添加微量磷酸三钙颗粒（TCP Particles）

研究进一步在支架中添加微量（0.5%）TCP颗粒以增强调控效应。体外数据显示，结合了TCP的支架在促进MSC-RUNX2和成熟期骨蛋白（Osteocalcin, OCN）表达方面有更显著改善，其中15% BECM组仍为最佳。

5. 体内实验验证：小鼠颅骨缺损模型中的内源性修复

利用小鼠Critical-Sized Cranial Bone Defect Model（临界尺寸颅骨缺损模型），研究对BECM-μRB支架在内源性骨再生中的促进作用进行了系统评估。microCT影像观察发现，15%组BECM结合TCP颗粒后，在第2周有效填充了缺损（≈55%），并显著提升了新生骨的骨密度（Bone Mineral Density, BMD）。此外，15%组还表现出最高的血管生成水平（CD31 Immunostaining）。

6. 免疫调节与巨噬细胞表型作用

研究探讨了BECM对巨噬细胞（Macrophages, M𝜓ϕ）免疫反应的调控作用。支架体内植入1周后，15%-25%的BECM组显著降低了促炎性M1表型的比例（CD86+），并对骨组织修复贡献了更具再生性的免疫环境。

研究结果与发现

  1. 成功开发了一种结合BECM与GelMA微带支架的新型大孔径生物材料，优化支架中BECM的含量（15%-25%之间）可显著增强其机械、生物及骨再生性能。
  2. TCP颗粒的适量协同应用进一步提高了BECM支架的成骨效果，证明矿化cue对骨再生方案的必要性。
  3. 在免疫环境方面，BECM支架通过调节巨噬细胞的表型反应，为骨再生创造了更有利的环境。

意义与贡献

  1. 本研究提供了一个创新的高效平台用于硬组织再生，尤其适用于Critical-Sized Bone Defects范畴。
  2. 微带支架的高度模块化特性允许将其他类型的TDECM整合到相似构建中，未来可在软骨、肌肉等组织再生领域得到广泛应用。
  3. 该研究表明，即使在无外源细胞或生长因子的情况下，通过BECM与TCP颗粒配合使用，仍可实现显著骨再生，降低了临床应用的复杂性和成本。

亮点

  1. 首创性的BECM共旋制备技术在宏观大孔支架中的首次应用。
  2. 证实了Minimally Invasive Scaffolds (μRB) 与多因素联合刺激在骨修复领域的新潜力。
  3. 提供了对骨免疫微环境调控和组织内源性愈合机制的新见解。

本文研究在骨组织工程领域具有极高的实用价值和科学意义，并为未来多种组织再生材料的发展提供了重要参考。