通过棕榈酰基转移酶调节的FoxP3蛋白棕榈酰化调控调节性T细胞功能

2024-08-01 Thu
独特的Foxp3棕榈酰化通过棕榈酰转移酶调控Tregs的功能免疫调节T细胞（Tregs）在维持机体免疫稳态和防止免疫过度应答中起着关键作用。作为抑制免疫反应的重要角色，Tregs有助于维持免疫耐受，从而防止自身免疫疾病的发生。然而，在肿瘤微环境（TME）中，Tregs通过多种机制削弱效应细胞的活性，从而促进肿瘤的发生和发展。Foxp3（叉头框蛋白P3）是Tregs关键的转录因子，其表达对于Tregs的发育和功能至关重要。众所周知，Foxp3可以通过多种翻译后修饰（包括磷酸化、泛素化、糖基化和乙酰化）被调控，但棕榈酰化这一翻译后修饰是否在生理条件和TME中调控Foxp3的功能仍未知。
研究背景与目的棕榈酰化是一种可逆的脂质翻译后修饰，通过硫酯键将16个碳的棕榈酰基添加到蛋白质的半胱氨酸残基上。棕榈酰化对于调节蛋白质的亚细胞定位、蛋白质-蛋白质相互作用、稳定性和信号转导活性至关重要。近期研究辨识出了棕榈酰化过程中的关键角色，尤以24种含Asp-His-His-Cys（DHHC）基序的棕榈酰转移酶家族为主，这些酶负责催化棕榈酰基到目标蛋白的添加。此外，多种脱棕榈酰化酶（如APT1/2、PPT1/2及ABHD17A/B/C）的发现揭示了去除棕榈酰基的过程。棕榈酰化和脱棕榈酰化之间的动态平衡对于调控蛋白质功能和细胞信号协调至关重要。本研究旨在检测Foxp3的棕榈酰化及其对抗肿瘤免疫反应的影响。
研究团队与发表信息这项研究由来自新乡医学院第二附属医院、精神与神经科学研究所、河南分子诊断与实验室医学协同创新中心等单位的多个团队共同完成。主要作者包括Binhu Zhou、Mengjie Zhang、Haoyuan Ma、Ying Wang和Eryan Kong等。这篇研究成果于2024年5月8日发表在《Cellular & Molecular Immunology》杂志上。
研究流程与实验方法研究首先通过HEK293T细胞中过表达Foxp3-Myc, 使用ABE（乙酰-生物素交换）和Acyl-RAC（乙酰树脂辅助捕获）实验确定Foxp3在体外的棕榈酰化状态。结果表明Foxp3确实发生了棕榈酰化。接下来，收集C57BL/6小鼠的淋巴结进行蛋白质提取和ABE检测，以Westen blot分析结果表明，Foxp3在淋巴结中也存在棕榈酰化。
为了确定Foxp3特定的棕榈酰化位点，研究设计并表达了带有Flag标签的Foxp3蛋白并进行质谱分析。结果显示，Foxp3在Cys204、Cys218、Cys280、Cys281和Cys424五个半胱氨酸残基处发生棕榈酰化，每个棕榈酰化事件导致蛋白质分子量增加238 Da。进一步的验证实验中，分别在HEK293T细胞中表达各种Foxp3突变体，并通过Acyl-RAC测量棕榈酰化水平。结果显示，对这些半胱氨酸残基进行丙氨酸替换会减少Foxp3的棕榈酰化水平，尤其是同时突变这五个半胱氨酸残基的5CA突变体几乎完全消除棕榈酰化。
接下来，研究通过共免疫沉淀（Co-IP）实验分析了Foxp3与多种棕榈酰转移酶之间的相互作用，结果确认了Foxp3与DHHC2、DHHC3、DHHC7、DHHC13、DHHC17、DHHC19和DHHC23的物理相互作用。通过定量实时PCR分析（qRT-PCR），发现这些棕榈酰转移酶中DHHC2、DHHC3和DHHC7在来自脾脏和肿瘤组织的Tregs中表达丰富。
为了进一步探究这些棕榈酰转移酶在Foxp3棕榈酰化中扮演的角色，研究进行了多个实验，包括Co-IP和Acyl-RAC分析，结果显示单独过表达DHHC2、DHHC3或DHHC7显著增加了Foxp3的棕榈酰化水平。
研究结果与结论为了进一步探讨Foxp3棕榈酰化在体内的功能，研究还生成了DHHC2-、DHHC3-和DHHC7整体敲除小鼠。流式细胞术数据显示，敲除DHHC2会导致淋巴结和脾脏中Foxp3蛋白表达减少。使用CRISPR/Cas9基因编辑技术，研究接下来对三种棕榈酰转移酶进一步分析，结果显示敲除DHHC3或DHHC7也会显著降低Foxp3蛋白在Tregs中的表达水平。
最终，研究在Foxp3-Cre小鼠中确认了这一现象，证实Foxp3的棕榈酰化对于TME中Tregs的抑 制功能具有重要作用。通过瘤内注射YUMM3.3黑色素瘤细胞，研究发现特异性失去DHHC2的小鼠表现出抑制肿瘤生长的现象，并显示肿瘤浸润Tregs中的Foxp3表达明显减少。
研究意义与价值这项研究首次揭示了Foxp3的棕榈酰化动态及其在抗肿瘤免疫中的关键作用。通过分析多种棕榈酰转移酶对Foxp3功能的调控，研究为开发靶向Tregs调控的免疫疗法提供了新的思路。
该研究的结果不仅深化了我们对Foxp3和Tregs的理解，还为未来针对肿瘤免疫逃避机制的研究提供了重要参考。研究所用的方法学（如质谱分析、CRISPR/Cas9基因编辑等）也展示了科学创新和实验设计的高度融合，其研究结论在进一步研究和临床应用中具有广泛潜力。