Analyse avancée à cellule unique et spatiale avec caractérisation hautement multiplexée des cellules tumorales circulantes et du tissu tumoral dans le cancer de la prostate : Révélation des mécanismes de résistance avec l'essai CODuco in situ
Le cancer de la prostate (Prostate Cancer, PC) est la troisième tumeur solide la plus fréquemment diagnostiquée chez les hommes dans le monde, avec environ 1,4 million de nouveaux cas estimés en 2020. Avec le vieillissement de la population mondiale, l’incidence du cancer de la prostate devrait continuer à augmenter, atteignant potentiellement 2,9 millions de cas d’ici 2040. Bien que les traitements aient progressé, la prise en charge du cancer de la prostate avancé reste un défi majeur, en particulier en raison de l’émergence de mécanismes de résistance. La dysrégulation de la voie du récepteur aux androgènes (Androgen Receptor, AR) joue un rôle clé dans le développement et la progression du cancer de la prostate, ce qui fait de la thérapie de privation androgénique (Androgen Deprivation Therapy, ADT) le traitement principal pour les stades avancés. Cependant, presque tous les patients finissent par développer une résistance à l’ADT, évoluant vers un cancer de la prostate résistant à la castration (Castration-Resistant Prostate Cancer, CRPC). De plus, des anomalies de la voie de signalisation AR (telles que l’amplification du gène AR, les mutations et l’expression de variants d’épissage comme AR-V7) ainsi que des mécanismes de résistance indépendants de l’AR, comme la transdifférenciation neuroendocrine, sont de plus en plus observés.
Actuellement, il manque des recommandations cohérentes basées sur des biomarqueurs pour des combinaisons de traitements individualisées optimales, et les outils cliniquement pratiques pour la stratification des patients et la surveillance de la résistance aux médicaments font défaut. La biopsie liquide (Liquid Biopsy), en tant que méthode peu invasive de surveillance de la maladie, a récemment attiré une attention considérable. Les cellules tumorales circulantes (Circulating Tumor Cells, CTCs) et l’ADN tumoral circulant (ctDNA) sont les principaux analytes utilisés dans la biopsie liquide. Cependant, la détection simultanée de multiples mécanismes de résistance et de biomarqueurs prédictifs reste un défi majeur. Auparavant, l’équipe de recherche a démontré l’application de la technique d’hybridation in situ de sondes Padlock basée sur l’ARNm pour la caractérisation des CTCs, mais cette technique présente des limitations en termes de débit de détection et de temps d’évaluation manuel.
Objectif de l’étude
Pour résoudre ces problèmes, l’équipe de recherche a développé une nouvelle méthode de détection in situ d’ARNm à double couleur combinatoire (Combinatorial Dual-Color, CODuco), capable d’analyser simultanément jusqu’à 15 marqueurs différents. Cette méthode combine une capacité de détection multiplexée élevée et une analyse unicellulaire par microscopie, visant à révéler les multiples mécanismes de résistance dans les CTCs des patients atteints de cancer de la prostate et à fournir un outil de surveillance des changements moléculaires dynamiques.
Équipe de recherche et informations de publication
Cette étude a été menée par Lilli Bonstingl, Margret Zinnegger, Katja Sallinger et leur équipe de l’Université médicale de Graz (Medical University of Graz) en Autriche, et a été publiée en 2024 dans la revue Biomarker Research sous le titre Advanced single-cell and spatial analysis with high-multiplex characterization of circulating tumor cells and tumor tissue in prostate cancer: unveiling resistance mechanisms with the CODuco in situ assay.
Processus de l’étude
1. Collecte des échantillons de patients et approbation éthique
L’étude a inclus des patients atteints d’un cancer de la prostate métastatique avancé. Tous les patients ont signé un consentement éclairé, et l’étude a été menée conformément aux principes de la Déclaration d’Helsinki, avec l’approbation du comité d’éthique. Pour éviter la contamination par des cellules épithéliales, 2,5 ml de sang ont été prélevés pour des analyses non cellulaires avant la collecte des échantillons sanguins destinés aux analyses cellulaires.
2. Préparation des lignées cellulaires et des échantillons de PBMCs
Les lignées cellulaires de cancer de la prostate VCaP et PC-3, ainsi que la lignée cellulaire de cancer du poumon non à petites cellules NCI-H1299, ont été utilisées. Toutes les lignées cellulaires ont été cultivées et fixées selon des méthodes standard. Les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMCs) de témoins sains ont été isolées par centrifugation sur gradient de densité.
3. Enrichissement des CTCs et préparation des échantillons
Les CTCs ont été enrichis à partir de 7,5 ml d’échantillons sanguins en utilisant le Cytogen Smart Biopsy Cell Isolator pour la sélection négative et la filtration basée sur la taille. Les cellules enrichies ont été fixées au formaldéhyde et transférées sur des lames de microscope.
4. Hybridation in situ de sondes Padlock CODuco
La technique d’hybridation in situ CODuco a permis la détection simultanée de multiples marqueurs grâce à des étapes de transcription inverse ciblée, d’hybridation de sondes Padlock, d’amplification en cercle roulant et d’hybridation de sondes de détection fluorescentes. L’équipe a conçu des sondes pour 15 gènes, y compris des marqueurs hématopoïétiques, épithéliaux, spécifiques de la prostate et neuroendocrines.
5. Analyse d’image et classification par apprentissage automatique
L’analyse d’image a été réalisée à l’aide des bibliothèques Python open source CellProfiler et TissUUmaps. L’équipe a développé un modèle de classification basé sur un classifieur de forêt aléatoire pour identifier automatiquement les CTCs. Les ensembles de données d’entraînement et de test provenaient d’échantillons sanguins de témoins sains, certains échantillons contenant des cellules VCaP et PC-3.
6. Analyse des échantillons tissulaires
L’étude a également appliqué l’hybridation in situ CODuco à des échantillons de tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE), explorant les profils d’expression génique dans les tissus tumoraux.
Résultats principaux
1. Décodage des signaux in situ CODuco
La méthode CODuco a permis la détection simultanée de jusqu’à 11 marqueurs grâce à un codage à double couleur. L’équipe a réussi à décoder les signaux in situ dans les CTCs et les PBMCs, révélant les profils d’expression génique de différents types de cellules.
2. Validation de CODuco pour la caractérisation des CTCs
La méthode CODuco a été validée sur des PBMCs de témoins sains, les lignées cellulaires de cancer de la prostate VCaP et PC-3, et la lignée cellulaire de cancer du poumon NCI-H1299. Les résultats ont montré que CODuco pouvait clairement identifier les caractéristiques d’expression génique des différents types de cellules et distinguer significativement les PBMCs des cellules tumorales.
3. Entraînement et évaluation du classifieur
Le modèle de classification basé sur un classifieur de forêt aléatoire a montré une excellente performance sur les échantillons sanguins de témoins sains, avec un rappel (Recall) de 0,89 et une spécificité (Specificity) de 1,00 pour les CTCs. Sur les échantillons de patients, le classifieur a atteint un rappel de 0,76 et une spécificité de 0,99.
4. Analyse de l’hétérogénéité des CTCs chez les patients
L’étude a révélé l’hétérogénéité des CTCs chez les patients, y compris la présence de grappes de CTCs et les différences de profils d’expression entre les patients. Par exemple, des grappes de CTCs ont été détectées chez le patient PC-16, avec des différences significatives dans les profils d’expression.
5. Application de CODuco aux échantillons tissulaires
La méthode CODuco a été appliquée avec succès à des échantillons de tissus FFPE, révélant des différences d’expression génique entre les tissus non tumoraux et tumoraux. Par rapport aux échantillons de CTCs, les profils d’expression génique dans les tissus ont montré des changements significatifs, reflétant l’évolution de la tumeur sous la pression thérapeutique.
Conclusion
La méthode de détection in situ CODuco combine une capacité de détection multiplexée élevée et une analyse unicellulaire par microscopie, permettant d’identifier et de caractériser simultanément les CTCs présentant des phénotypes épithéliaux, épithéliaux-mésenchymateux et neuroendocrines, et de visualiser l’hétérogénéité des CTCs. Cette méthode présente un potentiel significatif pour surveiller les changements moléculaires dynamiques associés à la réponse aux médicaments et à la résistance chez les patients atteints de cancer de la prostate, en particulier dans la détection de la transdifférenciation neuroendocrine et de l’expression de PSMA.
Points forts de l’étude
- Capacité de détection multiplexée élevée : La méthode CODuco permet de détecter simultanément jusqu’à 15 marqueurs, améliorant considérablement la caractérisation des CTCs.
- Détection de la transdifférenciation neuroendocrine : CODuco a permis de détecter des marqueurs neuroendocrines, offrant un nouvel outil pour le diagnostic précoce et le traitement du cancer de la prostate neuroendocrine.
- Classification assistée par apprentissage automatique : Le classifieur basé sur une forêt aléatoire permet d’identifier efficacement les CTCs, réduisant le temps et les efforts nécessaires à l’évaluation manuelle.
- Résolution unicellulaire : CODuco fournit des données d’expression génique au niveau unicellulaire, révélant l’hétérogénéité des CTCs et la présence de grappes de CTCs.
Importance de l’étude
Cette étude fournit un nouvel outil pour le traitement personnalisé et la surveillance de la résistance dans le cancer de la prostate, en particulier dans le domaine de la biopsie liquide. Le développement et l’application de la méthode CODuco améliorent la sensibilité et la spécificité de la détection des CTCs, tout en offrant de nouvelles perspectives sur l’hétérogénéité tumorale et les mécanismes de résistance. À l’avenir, cette méthode pourrait être largement utilisée en clinique pour aider les médecins à mieux élaborer des plans de traitement et à surveiller la réponse des patients.