La protéine miniG empêche l’internalisation de SameGPCR et perturbe la signalisation intracellulaire en aval

Introduction

Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs) constituent la plus grande classe de protéines transmembranaires, régulant les réponses cellulaires aux stimuli externes tels que les hormones et les neurotransmetteurs. Les GPCRs transmettent des signaux en se liant aux protéines régulatrices de liaison aux nucléotides guanyliques (protéines G). La liaison d’un agoniste provoque un changement de conformation du récepteur, activant ainsi le complexe protéique hétérotrimérique G, ce qui déclenche une cascade de signalisation pouvant conduire à des effets cellulaires spécifiques. Une fois la signalisation terminée, l’activité GTPase intrinsèque de la sous-unité Gα permet le retour à son état inactif lié au GDP.

Ces dernières années, pour mieux étudier la structure des GPCRs, les scientifiques ont adopté la stratégie de co-expression de la sous-unité Gα thermostable (mini-protéine G) correspondante. Ces mini-protéines G peuvent stabiliser la conformation active des GPCRs. Cependant, l’utilisation de mini-protéines G s’étend de plus en plus, il est donc nécessaire de définir soigneusement les impacts potentiels de la co-expression des mini-protéines G sur l’internalisation des GPCRs et la signalisation intracellulaire.

Source de l’étude

Cet article, rédigé par Yusman Manchanda et ses collègues, provient de l’Imperial College London, de l’Université de Tohoku et de l’Université de Montréal. L’article a été publié dans le journal Science Signaling le 2 juillet 2024.

Méthodes expérimentales

Les auteurs rapportent que la surexpression des mini-protéines G avec leurs GPCRs correspondants entraîne des troubles de l’internalisation des GPCRs et une perturbation de la signalisation intracellulaire associée. Afin d’explorer en profondeur ce phénomène, les auteurs ont mené les étapes expérimentales suivantes :

Procédure expérimentale

1. Expérience de co-expression de GPCR et mini-Gs :

   • La co-expression de mini-Gs et du GPCR couplé à Gαs, le récepteur du peptide semblable au glucagon 1 (GLP-1R), a été réalisée dans des cellules HEK293 exprimant GLP-1R. Les mini-Gs et GLP-1R ont été marqués avec des étiquettes fluorescentes ou luminescentes, et leur distribution dans les cellules et leur internalisation ont été observées.

2. Expérience de transfert d’énergie par résonance dépendante de la bioluminescence nano (NanoBRET) :

   • Dans les cellules HEK293 coexprimant les mini-Gs et GLP-1R, la technique NanoBRET a été utilisée pour mesurer le transfert d’énergie à différents moments, afin de surveiller la quantité membranaire, l’internalisation et la signalisation intracellulaire des mini-Gs.

3. Analyse par microscope à fluorescence de colocalisation :

   • En utilisant la technique de colocalisation pas à pas dans les cellules HEK293 et INS-1 ⁸³²⁄₃, la colocalisation des mini-Gs et GLP-1R avec le marqueur précoce de l’endocytose Rab5 a été observée.

4. Recrutement de β-arrestine et GRK2 :

   • Utilisation des techniques NanoBRET et NanoBiT pour détecter le recrutement des protéines β-arrestine 2 et GRK2 (kinase des récepteurs couplés aux protéines G2) lors de la co-expression des mini-Gs.

     • Le transfert d’énergie a été mesuré dans GLP-1R marqué avec des étiquettes fluorescentes de β-arrestine 2 et GRK2 dans chaque condition, afin de surveiller leur recrutement sous différents conditions.

Résultats de la recherche

1. Les mini-Gs inhibent l’internalisation du GLP-1R :

   • Premier constat majeur : Dans les cellules co-exprimant les mini-Gs, le GLP-1R ne peut pas s’internaliser efficacement sous l’action de l’agoniste.
   • Données de soutien : Les expériences NanoBRET et l’analyse par microscope de colocalisation montrent que le signal NanoBRET ne diminue pas avec le temps avec l’internalisation du GLP-1R, indiquant que les mini-Gs restent fixés à la membrane cellulaire.

2. Les sous-unités mini-G inhibent sélectivement l’internalisation de leurs GPCRs correspondants :

   • La co-expression de différents types de mini-protéines G (mini-Gi et mini-Gq) est capable d’inhiber l’internalisation de leurs GPCRs correspondants.
   • La co-expression des sous-unités mini-G n’a pas été en mesure d’inhiber efficacement l’action des Gα endogènes, car les sous-unités Gα pleine longueur ont moins d’impact sur l’internalisation des GPCRs par rapport aux mini-protéines G.

3. Le recrutement de β-arrestine 2 est affecté :

   • Le recrutement complet de β-arrestine 2 indique que ce recrutement nécessite la dissociation de la sous-unité Gα, tandis que le recrutement de GRK2 est légèrement affecté, ne changeant pas de manière significative l’état de phosphorylation du GLP-1R.

4. Impact des mini-protéines G sur l’affinité de liaison du GPCR avec son ligand :

   • Dans les cellules co-exprimant les mini-Gs, l’affinité de liaison du GLP-1R avec ses ligands est augmentée, ce qui signifie que le récepteur reste dans une conformation active stable.

Conclusion et valeur

Cette étude révèle pour la première fois l’impact de la co-expression des mini-protéines G sur l’internalisation et la signalisation en aval de leurs GPCRs correspondants. Une des découvertes clés est que les mini-protéines G peuvent empêcher l’internalisation des GPCRs, modifiant ainsi les caractéristiques de leur signalisation intracellulaire. De plus, cette étude a des implications dans la conception de nouvelles méthodes d’évaluation de la signalisation des GPCRs, guide les futures expériences pour éviter les malentendus liés à la surexpression des sous-unités mini-G, améliorant ainsi l’exactitude de la pharmacologie moléculaire et de la recherche sur la signalisation des GPCRs.

Points forts et innovations de la recherche

L’inhibition sélective de l’internalisation par les différentes sous-unités mini-G après la co-expression des mini-protéines G est rapportée pour la première fois. Cette découverte est non seulement significative dans la recherche académique, mais elle peut également mener à la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques et de nouvelles thérapies. De plus, l’article propose une nouvelle méthode utilisant les nano-anticorps Nb37, permettant une détection plus précise de la signalisation intracellulaire sans affecter l’internalisation du GLP-1R.

Résumé

Cet article révèle l’effet inhibiteur significatif des mini-protéines G sur l’internalisation de leurs GPCRs correspondants et la signalisation en aval, offrant de nouvelles perspectives et méthodes de recherche sur la signalisation des GPCRs. À travers ces expériences et observations approfondies, cet article apporte des données précieuses à la communauté scientifique, approfondissant notre compréhension des mécanismes de signalisation des GPCRs.