Remplacement complet par des nucléotides modifiés dans l'ARN auto-amplifiant supprime la réponse interféron et augmente la puissance

Génétique Génie biologique Sciences de la vie Biologie cellulaire
nucléotides modifiés ARN auto-amplifiant réponse interféron expression protéique vaccin SARS-CoV-2

Introduction

Sous l’impulsion de la pandémie de COVID-19, la technologie des vaccins à ARNm a connu des avancées significatives, mais sa courte demi-vie et ses besoins en haute dose ont entraîné des effets secondaires et des problèmes d’accessibilité. Pour surmonter ces défis, l’ARN auto-amplifiant (self-amplifying RNA, saRNA) est devenu un sujet de recherche central. Le saRNA utilise l’ARN-polymérase dépendante de l’ARN (RNA-dependent RNA polymerase, RdRP) provenant des alphavirus pour une auto-réplication, permettant théoriquement de réduire la dose et la fréquence des injections afin d’améliorer l’efficacité et la sécurité des vaccins. Cependant, les premières recherches sur le saRNA ont montré que la forte réponse en interféron (Interferon, IFN) qu’il induit peut inhiber l’expression de l’antigène, réduisant ainsi l’efficacité du vaccin. Cette étude vise à utilisant des nucléotides modifiés de remplacement total, inhiber la réponse en interféron et améliorer l’expression des protéines à long terme et l’efficacité de la protection du vaccin par le saRNA.

Contexte de l’étude

L’équipe de recherche vient de l’université de Boston, comprenant la section de bio-ingénierie, le centre de biodesign, les départements de virologie, d’immunologie et de microbiologie, le laboratoire national des maladies infectieuses émergentes, ainsi que le département de chimie. Les principaux auteurs Joshua E. McGee et Jack R. Kirsch, ainsi que d’autres co-auteurs, ont publié leur étude dans la revue Nature Biotechnology, révélant les applications et les avantages significatifs des nucléotides modifiés dans le saRNA.

Méthodologie de l’étude

L’étude est principalement divisée en plusieurs étapes :

  1. Construction et synthèse de la bibliothèque saRNA : Une série de constructeurs saRNA entièrement substitués par des nucléotides modifiés a été synthétisée par transcription in vitro (IVT). Ces constructeurs codent pour la protéine fluorescente mCherry pour évaluer leur fonctionnalité.
  2. Transfection et sélection in vitro : Les constructeurs saRNA ont été transfectés dans des cellules HEK293T à l’aide de liposomes. L’expression de mCherry a été détectée par cytométrie en flux et microscopie à fluorescence. Les résultats montrent que les constructeurs substitués par l’hydroxyméthylcytosine (hm5C), la méthylcytosine (m5C) ou l’uracile méthylé (m5U) présentent une efficacité de transfection significativement accrue.
  3. Évaluation de l’expression des protéines : Des expériences de transfection dans des cellules HEK293T, C2C12 et Jurkat montrent que le saRNA m5C présente des niveaux d’expression des protéines significativement plus élevés que le saRNA sauvage et l’ARNm n1-methylpseudouridine (n1mψ).
  4. Analyse de la réponse en interféron : Des expériences sur des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) humain montrent que le saRNA m5C réduit significativement l’expression de l’IFNα et de l’IFNβ, prouvant son efficacité pour inhiber la réponse précoce en interféron.
  5. Expériences in vivo : Les niveaux d’expression des protéines et l’efficacité vaccinale du saRNA m5C ont été évalués chez des modèles murins. Les résultats montrent que le saRNA m5C fournit une protection significative avec une faible dose et induit une réponse anticorps plus durable comparée à l’ARNm n1mψ et au saRNA sauvage.

Résultats de l’étude

Transfection et sélection in vitro

L’étude montre que le saRNA entièrement substitué par des nucléotides modifiés a une efficacité de transfection significativement plus élevée dans les cellules HEK293T par rapport au saRNA sauvage et à l’ARNm n1mψ. Spécifiquement, le saRNA m5C a une efficacité de transfection accrue de 14 fois, tandis que hm5C et m5U sont accrus de 10 et 8 fois respectivement. Ces résultats ont été confirmés par analyses en cytométrie en flux et microscopie à fluorescence.

Évaluation de l’expression des protéines

Dans les cellules HEK293T et C2C12, les niveaux d’expression des protéines du saRNA m5C étaient respectivement 68 et 314 fois supérieurs à ceux du saRNA sauvage. Les expériences dans les cellules Jurkat montrent également que le saRNA m5C peut augmenter significativement l’expression des protéines même à faible dose. Ces résultats démontrent la capacité exceptionnelle du saRNA m5C à exprimer des protéines dans les modèles in vitro.

Analyse de la réponse en interféron

Les expériences sur les PBMC humains montrent que le saRNA m5C réduit significativement l’expression de l’IFNα et de l’IFNβ. Concrètement, le saRNA m5C réduit l’expression de l’IFNα1 et de l’IFNβ1 par 8,5 et 3 fois respectivement. Cela indique que le saRNA m5C est particulièrement efficace pour inhiber la réponse précoce en interféron, améliorant ainsi l’efficacité et la sécurité du vaccin.

Expériences in vivo

Chez les modèles murins, le saRNA m5C montre une expression prolongée des protéines et une protection vaccinale significative. Les souris injectées avec le saRNA m5C montrent une haute survie et une réponse anticorps notable après un défi avec une dose létale de SARS-CoV-2. En particulier, dans le groupe à faible dose, le saRNA m5C a induit un titre d’anticorps nettement supérieur à celui du saRNA sauvage et de l’ARNm n1mψ, démontrant son efficacité même à faible dose.

Conclusion

Cette étude démontre que le saRNA entièrement substitué par des nucléotides modifiés peut significativement inhiber la réponse en interféron, augmenter l’expression des protéines et fournir une protection vaccinale efficace à faible dose. Cette découverte aide non seulement à améliorer l’efficacité et la sécurité des vaccins saRNA, mais offre également de nouvelles perspectives sur le potentiel du saRNA dans les thérapies géniques et d’autres applications.

Points forts de l’étude

  1. Méthode innovante : La recherche démontre pour la première fois que la substitution totale par des nucléotides modifiés peut significativement augmenter l’efficacité de transfection et les niveaux d’expression des protéines du saRNA.
  2. Expression protéique significative : Le saRNA m5C montre une capacité exceptionnelle à exprimer des protéines dans diverses lignées cellulaires, particulièrement à faible dose.
  3. Inhibition de la réponse en interféron : Le saRNA m5C peut efficacement inhiber la réponse précoce en interféron, réduisant les réactions inflammatoires et améliorant la sécurité et l’efficacité du vaccin.
  4. Protection vaccinale durable : Les expériences in vivo montrent que le saRNA m5C peut fournir une protection vaccinale durable à faible dose et induire une forte réponse anticorps.

Valeur de l’étude

Cette recherche fournit une base scientifique importante pour le développement de la technologie saRNA, en particulier dans les domaines des vaccins et des thérapies géniques. En inhibant la réponse en interféron et en augmentant l’expression des protéines, l’application des nucléotides modifiés devrait améliorer l’efficacité et la sécurité des vaccins saRNA, réduire les besoins en doses et les effets secondaires, facilitant ainsi la diffusion et le développement des technologies saRNA dans des applications pratiques.

Perspectives futures

Les recherches futures devront évaluer davantage la sécurité et l’efficacité du saRNA m5C au niveau clinique, en particulier chez les primates non humains et les humains. De plus, l’exploration de la compatibilité et des interactions des nucléotides modifiés dans d’autres formats d’ARN contribuera à libérer pleinement le potentiel de la technologie saRNA. Grâce à des recherches et des innovations continues, le saRNA pourrait apporter des avancées révolutionnaires dans les domaines des vaccins et des thérapies géniques.