TPN10475 inhibe l’activation des lymphocytes T effecteurs et atténue l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale en favorisant la signalisation du TGF-β

Introduction

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire démyélinisante du système nerveux central (SNC) médiée par les cellules immunitaires, avec une étiologie complexe et des mécanismes pathogènes peu clairs. La SEP se caractérise par des déficits neurologiques chez les jeunes adultes et est une maladie invalidante non traumatique dont la prévalence augmente dans le monde entier. Bien que les traitements existants contre la SEP aient permis de contrôler la maladie dans une certaine mesure, leurs effets secondaires et les événements indésirables graves liés aux médicaments restent des défis médicaux majeurs.

L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est couramment utilisée comme modèle animal de la SEP pour étudier les mécanismes pathogènes de la maladie et les traitements potentiels. La pathologie et l’histologie de l’EAE sont très similaires à celles de la SEP, caractérisées principalement par une infiltration anormale de cellules inflammatoires dans le SNC, entraînant une démyélinisation des axones neuronaux.

Dans la pathogenèse de la SEP, les lymphocytes T CD4+ sont des acteurs clés, en particulier les cellules Th1 et Th17, qui endommagent la moelle épinière et les axones en produisant des facteurs inflammatoires et des cytokines, et attirent davantage de cellules inflammatoires pour aggraver la réaction inflammatoire. De plus, les lymphocytes T CD4+ peuvent également supprimer la fonction des lymphocytes T CD4+ effecteurs par le biais de lymphocytes T régulateurs CD4+ spécifiques (Treg) et d’autres mécanismes de rétroaction régulatrice, régulant ainsi à la baisse l’inflammation.

Le facteur de croissance transformant β (TGF-β) est une importante classe de signaux intercellulaires qui contrôlent la prolifération, la différenciation et la migration cellulaires. Il transmet des signaux par l’intermédiaire de complexes récepteurs à la surface des cellules, régulant finalement l’expression des gènes cibles. Des études ont montré que le TGF-β joue un rôle important dans l’immunorégulation, notamment en inhibant la prolifération, la différenciation et l’activation des cellules immunitaires.

L’artémisinine et ses dérivés sont non seulement connus pour leur action antipaludique, mais ils ont également montré ces dernières années une puissante activité immunosuppressive, avec des effets thérapeutiques significatifs dans les maladies auto-immunes telles que la SEP et la polyarthrite rhumatoïde. Le dérivé de l’artémisinine TPN10466 a montré un effet protecteur dans l’EAE murine en renforçant l’expansion et la fonction des cellules Treg.

Cette étude se concentre sur un nouveau dérivé de l’artémisinine, le TPN10475, et vise à explorer son effet atténuant sur l’EAE et ses mécanismes possibles. Les résultats montrent que le TPN10475 peut efficacement contrer la diminution de la signalisation du TGF-β induite par la stimulation du signal TCR, inhiber l’activation fonctionnelle des lymphocytes T CD4+ effecteurs et limiter la différenciation des cellules Th1 et Th17 pathologiques. De plus, le TPN10475 a atténué l’EAE en réduisant l’activation des lymphocytes T auxiliaires auto-réactifs périphériques et en inhibant la migration des cellules inflammatoires vers le SNC.

Matériels et méthodes

Les souris utilisées dans cette étude étaient des souris C57BL/6 mâles âgées de 6 à 8 semaines, toutes achetées auprès de Gempharmatech et élevées dans les installations de soins aux animaux de l’Université Tongji. Toutes les procédures expérimentales sur les animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique de la recherche animale de l’Université Tongji.

Isolation et polarisation in vitro des lymphocytes T CD4+

Les lymphocytes T CD4+ ont été purifiés à partir de splénocytes de souris en utilisant la technique de sélection magnétique des cellules, puis activés avec des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 de souris et polarisés dans un milieu de culture RPMI 1640 contenant différentes cytokines.

Détection de la prolifération et de la viabilité cellulaires

Le colorant carboxyfluorescéine diacétate succinimidyl ester (CFSE) a été utilisé pour suivre la division cellulaire des lymphocytes, et la solution Cell Counting Kit-8 (CCK8) a été utilisée pour évaluer la croissance des cellules HEK293T.

Analyse par cytométrie en flux

La cytométrie en flux a été utilisée pour analyser l’expression des marqueurs de surface cellulaire et des cytokines dans les expériences in vitro et in vivo, afin de détecter l’activité et l’apoptose cellulaires.

PCR quantitative en temps réel

L’ARN total des lymphocytes T CD4+ a été extrait, rétrotranscrit en ADNc et l’expression de gènes spécifiques a été détectée par PCR quantitative en temps réel.

Test d’immunoabsorption enzymatique (ELISA)

Des kits ELISA commerciaux ont été utilisés pour détecter les concentrations de cytokines pro-inflammatoires et anti-inflammatoires dans les surnageants de culture cellulaire et le sérum de souris.

Induction et évaluation de l’EAE

L’EAE a été induite par immunisation sous-cutanée des souris avec le peptide MOG35-55. Les changements de poids corporel et les scores cliniques des souris ont été évalués, et l’analyse pathologique a été utilisée pour évaluer l’infiltration des cellules inflammatoires et la démyélinisation de la substance blanche dans la moelle épinière.

Analyse du séquençage de l’ARN

L’ARN total des lymphocytes T CD4+ a été extrait et une analyse RNA-seq a été effectuée pour identifier les gènes différentiellement exprimés, suivie d’analyses de cartes thermiques, de diagrammes en volcan, d’analyses des voies KEGG et d’analyses d’ontologie génique (GO).

Analyse statistique

Les données expérimentales sont présentées sous forme de moyenne ± erreur standard. Les analyses statistiques ont été effectuées à l’aide de tests t de Student bilatéraux non appariés ou de tests U de Mann-Whitney, avec une signification statistique définie comme P < 0,05.

Résultats

TPN10475 inhibe la prolifération et la fonction effectrice des lymphocytes T CD4+

Les expériences in vitro ont démontré que le TPN10475 inhibait significativement la génération de lymphocytes T CD4+ mémoires effecteurs induite par l’activation anti-CD3/CD28. Une analyse plus approfondie a montré qu’il inhibait également de manière significative la sécrétion d’IFN-γ et de TNF-α par les lymphocytes T CD4+ mémoires effecteurs. Cela indique que le TPN10475 a un effet inhibiteur sur la fonction des lymphocytes T CD4+ mémoires effecteurs.

TPN10475 limite le développement des cellules Th1 et Th17

Des études plus approfondies ont révélé que le TPN10475 pouvait inhiber la génération de cellules Th1 et Th17 de manière dose-dépendante, tout en ayant un léger effet promoteur sur les cellules Treg. Le TPN10475 a également inhibé la capacité des cellules Th1 à sécréter l’IFN-γ et le TNF-α, ainsi que la capacité des cellules Th17 à sécréter l’IL-17A et le GM-CSF.

TPN10475 atténue les symptômes cliniques chez les souris EAE

En administrant différentes doses de TPN10475 par voie orale aux souris EAE, les résultats ont montré que le TPN10475 non seulement atténuait les symptômes cliniques des souris EAE, mais retardait également l’apparition de la maladie. L’analyse pathologique a montré que le TPN10475 réduisait significativement l’infiltration des cellules inflammatoires dans la moelle épinière et la zone de démyélinisation de la substance blanche.

TPN10475 inhibe la réponse inflammatoire dans le SNC

L’analyse par cytométrie en flux a montré que la proportion de lymphocytes T CD4+ infiltrant le SNC était significativement réduite dans le groupe traité par TPN10475, en particulier la proportion de sous-populations Th17 et Th1-like Th17. Cela indique que le TPN10475 peut réduire l’infiltration des cellules inflammatoires dans le SNC.

TPN10475 inhibe l’activation inflammatoire au début de l’EAE

L’étude a révélé une réduction significative de la sécrétion de cytokines inflammatoires dans le sérum périphérique des souris du groupe traité au début de la maladie, indiquant que le TPN10475 peut produire un effet inhibiteur significatif sur l’inflammation dès le début de l’EAE.

TPN10475 régule la réponse immunitaire des tissus périphériques au début de l’EAE

L’analyse par cytométrie en flux a montré que le TPN10475 réduisait significativement la proportion de lymphocytes T CD4+ dans la rate et les ganglions lymphatiques périphériques des souris EAE, tout en réduisant significativement la proportion de cellules Th1, Th17 et Th1-like Th17, et en favorisant la génération de cellules Treg. De plus, le TPN10475 a significativement réduit les niveaux de cytokines inflammatoires sécrétées par les cellules immunitaires périphériques, validant davantage son effet immunorégulateur.

TPN10475 inhibe l’activation des lymphocytes T CD4+ effecteurs en renforçant la voie de signalisation du récepteur TGF-β

L’analyse du séquençage de l’ARN a montré que le TPN10475 affectait significativement la voie de signalisation du récepteur TGF-β et la régulation négative de la réponse inflammatoire, augmentant les niveaux d’expression des gènes liés à la voie de signalisation du récepteur TGF-β. Les résultats expérimentaux ont en outre confirmé que le TPN10475 inhibait l’activation des lymphocytes T CD4+ effecteurs en favorisant la voie de signalisation du TGF-β et limitait la différenciation des cellules Th1 et Th17.

L’inhibition de la signalisation du TGF-β inverse l’effet du TPN10475 sur les lymphocytes T CD4+ activés

En utilisant l’inhibiteur du récepteur du TGF-β LY2109761 pour interférer avec les lymphocytes T CD4+, il a été constaté que le blocage de la signalisation du TGF-β pouvait inverser l’effet inhibiteur du TPN10475 sur les lymphocytes T CD4+ activés, confirmant davantage le mécanisme par lequel le TPN10475 inhibe l’activation des lymphocytes T CD4+ effecteurs en favorisant la voie de signalisation du TGF-β.

Conclusion

Cette étude a révélé que le dérivé de l’artémisinine TPN10475, en favorisant la signalisation du TGF-β, inhibe significativement la prolifération et l’activation des lymphocytes T CD4+ effecteurs, limite la différenciation des cellules Th1 et Th17 pathologiques, et atténue l’EAE en réduisant l’activation des lymphocytes T auxiliaires auto-réactifs périphériques et la migration des cellules inflammatoires vers le système nerveux central. Cette recherche fournit une référence précieuse pour l’étude future du traitement des maladies auto-immunes et offre une base potentielle pour la régulation de la voie de signalisation du TGF-β afin de soulager l’EAE.