デアミナーゼを用いた転写因子の全ゲノム単一細胞および単一分子フットプリンティング
ゲノムワイドな単一細胞および単一分子レベルでの転写因子フットプリント解析
学術的背景
ヒトや他の哺乳類において、すべての体細胞は基本的に同じゲノムを持っていますが、異なる細胞タイプはそれぞれ異なる機能を果たします。この違いは主に、転写因子（Transcription Factors, TFs）が遺伝子の調節領域に結合することによって決定されます。TFsはDNAからRNAへの転写を制御することで遺伝子発現を調節します。TFsがどのようにゲノムに結合するかを理解することは、機能ゲノミクス研究の中核的な課題の一つです。しかし、既存の研究方法には一定の限界があります。従来の「ボトムアップ」アプローチ（原子分解能構造や単一分子イメージングなど）や「トップダウン」アプローチ（古典的な遺伝学や分子生物学など）は多くの貴重な情報を提供してきましたが、単一細胞および単一分子レベルでTFsの結合パターンを包括的に明らかにすることはできませんでした。
これらの制限を克服するため、本研究では「デアミナーゼを用いたフットプリント解析」（Footprinting with Deaminase, FOODIE）という新技術を開発しました。この技術は、単一細胞および単一分子レベルでTFsの結合部位をゲノムワイドに正確に検出することができます。さらに、隣接するTFs間の協調作用も検出可能であり、遺伝子調節ネットワークの理解に新たな視点を提供します。
論文の出典
本論文は、Runsheng He、Wenyang Dong、Zhi Wangら、Changping LaboratoryやPeking Universityなどの研究チームによって共同で執筆され、2024年12月17日に『PNAS』誌に掲載されました。論文の責任著者はXiaoliang Sunney Xieで、彼のチームは単一分子ゲノミクスや転写調節分野で深い研究実績を持っています。
研究の流れ
1. FOODIE技術の開発と最適化
FOODIE技術の核心は、二本鎖DNAデアミナーゼ（Deaminase）を用いてDNAを修飾し、TFsが結合している部位のシトシンが脱アミノ化されないようにすることで、単一分子シーケンシングにおいてフットプリントを残すというものです。研究チームはまず、複数のデアミナーゼをテストし、最終的にDDDBとMGYPDA829という2種類の酵素を選択しました。これらは広範な配列条件下でシトシンをウラシルに効率的に変換できるためです。
2. 実験の流れ
FOODIEの実験プロセスは以下の主要なステップで構成されています：
- 細胞の透過性処理とクロマチン開放領域の濃縮：Tn5トランスポザーゼを使用して細胞を透過性処理し、クロマチン開放領域を濃縮します。これらの領域は通常、TFsが結合する主要な部位です。
- 脱アミノ化反応：Tn5処理後、デアミナーゼを加えて反応させます。TFsが結合している部位は立体障害によって脱アミノ化されませんが、結合していない部位は修飾されます。
- 単一分子シーケンシング：脱アミノ化処理されたDNAを単一分子シーケンシングし、シトシンの変換率を分析することでTFsの結合部位を特定します。
- データ解析：データの可視化と解析のための専用アルゴリズムとウェブサーバー（http://foodie.sunneyxielab.org）を開発しました。
3. 単一細胞FOODIE（scFOODIE）の応用
異質な組織における細胞タイプ特異的なTFsフットプリント解析を行うため、研究チームは単一細胞FOODIE技術を開発しました。マウス海馬体の約11,200細胞を分析し、8つの主要な細胞タイプを特定し、異なる細胞タイプにおけるTFsの結合パターンを検出しました。例えば、海馬体錐体細胞ではAP-1のフットプリントが検出され、これはAP-1がシナプス活動と可塑性において果たす既知の機能と一致しています。
主な結果
1. TFsフットプリントのゲノムワイド分布
FOODIE技術を用いて、研究チームはゲノムワイドでTFsの結合部位をマッピングし、TFsの結合部位が主に遺伝子のプロモーターとエンハンサー領域に分布していることを発見しました。例えば、CTCFの結合部位は転写開始部位（TSS）の上流に、YY1の結合部位は下流に位置していました。
2. TFs間の協調作用の検出
FOODIE技術は、隣接するTFs間の協調作用も検出できます。研究では、特定のTFs間に正の協調作用（例：RFXとCREB）が存在する一方で、他のTFs間には負の協調作用（例：NRF1の2つの結合部位）が存在することが明らかになりました。この協調作用は、タンパク質間相互作用や競合的な結合によって実現されている可能性があります。
3. 遺伝子モジュール内の共有TFs
研究チームはまた、特定の生物学的機能を実行する遺伝子モジュール（Correlated Gene Modules, CGMs）が、共有のTFsによって調節されていることを発見しました。例えば、細胞周期関連の遺伝子モジュールでは、E2F因子がプロモーター領域で顕著に濃縮されており、免疫システム調節の遺伝子モジュールでは、RelBがエンハンサー領域で顕著に濃縮されていました。これは、異なる遺伝子モジュールの調節モードに大きな違いがあることを示唆しています。
結論と意義
FOODIE技術は、単一細胞および単一分子レベルでTFsの結合パターンを研究するための強力なツールを提供します。この技術は、TFsの結合部位を正確に検出するだけでなく、隣接するTFs間の協調作用を明らかにすることで、遺伝子調節ネットワークの理解に新たな視点を提供します。さらに、FOODIE技術は高スループットで低コストであるため、臨床サンプルやヒト組織での幅広い応用が期待されます。
研究のハイライト
- 高精度検出：FOODIE技術は、単一細胞および単一分子レベルでTFsの結合部位をゲノムワイドに正確に検出できます。
- 協調作用の解析：この技術は、隣接するTFs間の協調作用を検出し、遺伝子調節ネットワークの理解に新たな視点を提供します。
- 幅広い応用の可能性：FOODIE技術は高スループットで低コストであり、さまざまな細胞タイプや組織サンプルに適用可能です。
その他の貴重な情報
研究チームは、FOODIE技術によって生成されたデータを保存・共有するためのオープンデータベース（http://foodie.sunneyxielab.org）も開発しました。このデータベースは、他の研究者にとって貴重な研究リソースとなり、転写調節分野のさらなる発展を促進することが期待されます。
本研究を通じて、TFsが遺伝子調節において果たす役割を深く理解するとともに、今後の機能ゲノミクス研究のための新たな技術的手段を提供しました。