低真空走査型電子顕微鏡における組織構造のウラン不使用イメージング

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ウランを使用しないKMnO₄/Pb染色による低真空走査型電子顕微鏡での組織構造のイメージング

学術的背景

電子顕微鏡（Electron Microscopy, EM）は、細胞や組織の超微細構造を研究するための最も強力なツールの一つです。しかし、従来の生物試料の金属染色法では、有害なウラン化合物を使用する必要があり、これが電子顕微鏡の広範な応用を妨げていました。近年、超解像蛍光顕微鏡の発展により、多くの細胞生物学者が免疫細胞化学技術に注目していますが、蛍光標識は依然としてこれらの技術の基盤となっています。そのため、電子顕微鏡観察は不可欠な手法であり、生物学における細胞/組織構造と機能の相関を明らかにするために、新たなデバイスや手法が開発されています。

低真空走査型電子顕微鏡（Low-Vacuum Scanning Electron Microscopy, LVSEM）は、非導電性試料の高解像度イメージングを可能にします。これは、残留ガス分子中の正イオンが非導電性材料に蓄積する負電荷を中和するためです。しかし、従来の金属染色法ではウラン化合物を使用する必要があり、これがLVSEMの広範な応用を制限していました。そのため、安全で迅速かつウランを使用しない金属染色法の開発が重要な研究目標となっています。

論文の出典

本論文は、Akira Sawaguchi、Takeshi Kamimura、Kyoko Kitagawa、Yoko Nagashima、Nobuyasu Takahashiらによって執筆され、それぞれ宮崎大学医学部解剖学部門の超微細細胞生物学部門および日立ハイテク株式会社に所属しています。この論文は2024年に「npj Imaging」誌に掲載され、タイトルは「KMnO₄/Pb staining allows uranium-free imaging of tissue architectures in low vacuum scanning electron microscopy」です。

研究の流れ

1. 試料の調製

研究では、10週齢の雄性Wistarラットを使用し、左心室から10%ホルマリン（4%パラホルムアルデヒド）または2%パラホルムアルデヒドと2.5%グルタルアルデヒドの混合液を灌流して固定しました。その後、腎臓、肺、気管、耳介などの臓器を取り出し、さらに2時間固定し、自動組織処理装置を用いて脱水およびパラフィン包埋を行いました。最終的に、5マイクロメートルまたは20マイクロメートルの厚さのパラフィン切片を作成しました。

2. 光学顕微鏡とLVSEMの相関イメージング

パラフィン切片は脱パラフィンおよび再水和後、ヘマトキシリンとエオシン（H&E）染色を行い、光学顕微鏡下で観察しました。観察後、切片をキシレン中に18～24時間浸漬してカバーガラスを除去し、その後金属染色を行いました。

3. KMnO₄/Pb金属染色

切片はまず0.2%過マンガン酸カリウム（KMnO₄）で5分間処理し、その後レイノルズのクエン酸鉛溶液（Pb）で3分間染色しました。グレースケールヒストグラム分析により、最適なKMnO₄濃度と処理時間を決定しました。

4. LVSEMイメージング

染色後の切片はLVSEM（日立ハイテク株式会社のTM4000Plus II）で観察し、加速電圧は5、10、15、または20 kVとしました。半自動タイル撮影技術により、切片全体のモンタージュ画像を取得しました。

主な結果

1. KMnO₄/Pb染色の最適化

グレースケールヒストグラム分析により、最適なKMnO₄濃度は0.2%、処理時間は5分間であることが決定されました。従来のウラン/鉛（Ur/Pb）染色と比較して、KMnO₄/Pb染色は腎小体、尿細管、尿管の移行上皮、甲状腺濾胞上皮などの組織で同様の染色効果と画像コントラストを示しました。

2. 元素分析

元素分析により、KMnO₄/Pb染色とUr/Pb染色の後方散乱電子（Backscattered Electron, BSE）信号強度は主に鉛（Pb）の沈着量によって決定されることが明らかになりました。KMnO₄酸化はPbの沈着を増強し、それによりBSE信号強度が向上しました。

3. 他のウランを使用しない染色法との比較

白金青/鉛（Pt-blue/Pb）、ウーロン茶抽出物/鉛（Ote/Pb）、サマリウム三酢酸/鉛（Sm/Pb）などのウランを使用しない染色法と比較して、KMnO₄/Pb染色は筋性動脈の内弾性板や弾性軟骨の間質基質でより高いコントラストを示しました。

4. 三次元イメージング

KMnO₄/Pb染色を厚切片LVSEMに適用し、腎小体、尿細管、肺気管支などの組織の三次元イメージングに成功し、複雑な細胞/組織構造を可視化しました。

結論

本研究では、ウランを使用しないKMnO₄/Pb金属染色法を開発し、低真空走査型電子顕微鏡下でパラフィン切片の多尺度イメージングを可能にしました。この方法は安全で迅速であり、画像コントラストは従来のUr/Pb染色と同等で、超微細構造観察に適しています。KMnO₄酸化はPbの沈着を増強し、特に弾性組織で独特の染色効果を示しました。

研究のハイライト

  1. ウランを使用しない染色法：KMnO₄/Pb染色は有害なウラン化合物の使用を回避し、生物医学電子顕微鏡の広範な応用に新たな道を開きました。
  2. 多尺度イメージング：センチメートルスケールの光学顕微鏡観察からナノメートルスケールのLVSEMイメージングまで、複雑な細胞/組織構造の包括的な分析を実現しました。
  3. 三次元イメージング：厚切片LVSEMとKMnO₄/Pb染色を組み合わせ、細胞/組織の三次元構造を可視化しました。
  4. ユーザーフレンドリー：この方法は特別な装置や技術を必要とせず、通常の病理診断や回顧的研究に適用可能です。

意義と価値

本研究は、生物医学研究に安全で効率的な電子顕微鏡イメージング法を提供し、特に組織病理学診断や三次元構造解析において重要な応用価値を持ちます。さらに、この方法は回顧的研究にも利用でき、長年保存されているパラフィン切片を用いた超微細構造分析を可能にし、生物医学研究の進展をさらに促進します。

ウランを使用しないKMnO₄/Pb染色法を開発することで、本研究は従来の染色法の安全性の問題を解決し、生物医学分野における電子顕微鏡の広範な応用に新たな道を開きました。