大動脈内皮細胞の動脈瘤好発部位における遺伝的および機能的特徴に関する研究

学術的背景

大動脈瘤（Aortic Aneurysm, AA）は、血管の特定部位における病的な拡張を特徴とする疾患であり、致命的な血管破裂を引き起こす可能性があります。大動脈瘤は通常、大動脈弓や腹部大動脈などの特定の好発部位に発生します。血流力学的要因が動脈瘤の形成に重要な役割を果たす一方で、血管壁の内在的な差異も関与しているかどうかは未だ明確ではありません。近年、内皮細胞（Endothelial Cells, ECs）が大動脈瘤の病態形成において重要な役割を果たしていることが明らかになってきています。内皮細胞は、異なる臓器や血管樹の異なる部位において顕著な異質性を示し、この異質性が動脈瘤の好発性に関連している可能性があります。

大動脈内皮細胞が動脈瘤形成において果たす役割を詳細に研究するため、研究者らはマウスの大動脈の特定部位から内皮細胞を分離するための改良された「Häutchen法」を開発し、RNAシーケンス（RNA-seq）を用いてその空間的異質性を分析しました。この研究は、健康なマウスの大動脈内皮細胞が動脈瘤好発部位において示す遺伝的および機能的な特徴を明らかにし、これらの特徴が疾患の発展においてどのような役割を果たすかを探ることを目的としています。

論文の出典

この研究は、Alexander Brückner、Adrian Brandtner、Sarah Rieckらによって行われ、ドイツのボン大学、リューベック大学、ボーフム大学などの研究機関からなるチームによって実施されました。論文は2024年7月4日に『Angiogenesis』誌にオンライン掲載され、タイトルは『Site-specific genetic and functional signatures of aortic endothelial cells at aneurysm predilection sites in healthy and AngII ApoE−/− mice』です。

研究の流れ

1. 内皮細胞の分離と処理

研究者らはまず、改良された「Häutchen法」を用いて、健康なC57BL/6マウスおよびAngII ApoE−/−マウスの大動脈の異なる部位から内皮細胞を分離しました。具体的な手順は以下の通りです：

• 大動脈の分離：マウスの胸腔と腹腔を開き、大動脈を分離して結合組織を取り除き、ヘパリン（250 IU/mL）で灌流しました。
• 大動脈の分割：大動脈を4つの部分に分け、それぞれ大動脈弓の上行部と下行部、胸部大動脈、腹部大動脈を代表させました。
• 内皮細胞の分離：改良された「Häutchen法」を用いて、大動脈の内皮細胞と中膜/外膜細胞を分離しました。具体的には、大動脈を切り開き、内皮面を下にしてガラスカバースリップの上に置き、予冷したガラスカバースリップを大動脈の外膜面に置き、機械的な力で表層細胞をガラスに転写しました。
• RNAの抽出：分離した内皮細胞からRNeasy Plus Micro Kit（Qiagen）を用いてRNAを抽出し、RNA-seq分析を行いました。

2. AngII ApoE−/−マウスモデルの作成

動脈瘤の形成を研究するため、研究者らはAngII ApoE−/−マウスモデルを使用しました。具体的な手順は以下の通りです：

• マウスの処理：10-18週齢のApoE−/−マウスをランダムにAngII群と対照群に分けました。AngII群のマウスにはAlzet浸透ポンプを埋め込み、AngII（1000 ng/kg/min）を14日または28日間持続投与しました。
• 疾患のモニタリング：Vevo 3100超音波装置を使用して動脈瘤の形成をモニタリングしました。

3. RNA-seq分析

研究者らは、分離した内皮細胞に対してRNA-seq分析を行い、異なる部位の内皮細胞の遺伝子発現の差異を比較しました。具体的な手順は以下の通りです：

• ライブラリの調製：Trio RNA-seq Library Preparation Kit（Tecan）を使用してRNA-seqライブラリを調製し、NextSeq 500シーケンサーでシーケンスを行いました。
• データ分析：Galaxyプラットフォームを使用してRNA-seqデータのバイオインフォマティクス分析を行い、遺伝子発現の差異分析、遺伝子オントロジー（GO）分析、ヒートマップの作成を行いました。

4. 内皮細胞の機械的特性の測定

研究者らは、原子間力顕微鏡（Atomic Force Microscopy, AFM）を使用して内皮細胞の皮質硬度を測定し、動脈瘤好発部位における機械的特性の変化を評価しました。

主な結果

1. 内皮細胞の分離と同定

改良された「Häutchen法」により、研究者らは健康なマウスの大動脈の異なる部位から高純度の内皮細胞を分離することに成功しました。RNA-seq分析により、内皮細胞と中膜/外膜細胞の遺伝子発現プロファイルに顕著な差異があることが確認され、この方法の有効性がさらに裏付けられました。

2. 内皮細胞の遺伝子発現の異質性

研究者らは、健康なマウスの大動脈の異なる部位の内皮細胞に顕著な遺伝子発現の異質性があることを発見しました。特に、動脈瘤好発部位（大動脈弓の上行部や腹部大動脈）では、細胞外マトリックスのリモデリング、血管新生、炎症に関連する遺伝子の発現が上昇していました。

3. AngII ApoE−/−マウスモデルにおける遺伝子発現の変化

AngII ApoE−/−マウスモデルにおいて、研究者らは動脈瘤形成部位の内皮細胞の遺伝子発現パターンが、健康なマウスの動脈瘤好発部位の遺伝子発現パターンと類似していることを発見しました。これは、健康なマウスの大動脈内皮細胞の異質性が動脈瘤の形成部位と病理学的変化を決定している可能性を示唆しています。

4. 内皮細胞の機械的特性の変化

AFM測定により、研究者らは動脈瘤好発部位の内皮細胞の皮質硬度が顕著に増加していることを発見しました。これは、内皮機能障害の早期兆候である可能性があります。

結論

この研究は、健康なマウスの大動脈内皮細胞が動脈瘤好発部位において示す遺伝的および機能的な異質性を明らかにし、この異質性が動脈瘤の形成部位と病理学的変化を決定している可能性を示唆しています。研究結果は、大動脈瘤の病態メカニズムをさらに理解するための新たな視点を提供し、将来の治療戦略に対する潜在的なターゲットを示しています。

研究のハイライト

• 改良された「Häutchen法」：この研究では、大動脈の特定部位から効率的に内皮細胞を分離するための改良された「Häutchen法」が開発され、内皮細胞の異質性を研究するための重要なツールを提供しました。
• 内皮細胞の遺伝子発現の異質性：健康なマウスの大動脈の異なる部位の内皮細胞に顕著な遺伝子発現の異質性があることが明らかになり、特に動脈瘤好発部位では、細胞外マトリックスのリモデリング、血管新生、炎症に関連する遺伝子の発現が上昇していました。
• AngII ApoE−/−マウスモデルによる検証：AngII ApoE−/−マウスモデルにおいて、動脈瘤形成部位の内皮細胞の遺伝子発現パターンが健康なマウスの動脈瘤好発部位の遺伝子発現パターンと類似していることが確認され、内皮細胞の異質性が動脈瘤形成において重要な役割を果たしていることがさらに裏付けられました。
• 内皮細胞の機械的特性の変化：動脈瘤好発部位の内皮細胞の皮質硬度が顕著に増加していることが発見され、これは内皮機能障害の早期兆候である可能性があり、動脈瘤の早期診断に役立つ可能性があります。

研究の意義

この研究は、大動脈内皮細胞が動脈瘤形成において果たす重要な役割を明らかにし、将来の治療戦略に対する新たな視点を提供しました。内皮細胞の異質性をターゲットとすることで、大動脈瘤の予防や治療に役立つ可能性があります。さらに、改良された「Häutchen法」は、他の血管疾患における内皮細胞の異質性を研究するための重要なツールを提供しています。