高浸透圧ストレスはTRPMLチャネルを介した細胞内Ca2+シグナルに依存して尿細管上皮細胞におけるTFEBの核移行を促進する

2025-04-20 Sun
高浸透圧転写因子EB (TFEB) カルシニューリン TRPML1 尿細管上皮細胞
近年、細胞自食（オートファジー）は、重要な細胞内分解およびリサイクルメカニズムとして、細胞恒常性の維持や様々なストレス条件への対応において重要な役割を果たしています。特に腎臓の近位尿細管上皮細胞では、虚血、毒性損傷、炎症などの一般的な腎臓損傷に対処するために自食活動が不可欠です。しかし、自食が細胞ストレス適応において果たす役割は広く研究されているものの、高浸透圧ストレス（ハイパーオスモティックストレス）がどのように自食を誘導するかについての分子メカニズムはまだ明らかになっていません。高浸透圧ストレスは機械的ストレスとして、細胞内外の浸透圧差を変化させることで細胞機能に影響を与えますが、具体的にどのように自食経路を調節するかは未解決の謎です。
転写因子EB（TFEB）は、自食-リソソーム経路の主要な転写調節因子であり、自食およびリソソーム関連遺伝子の発現を調節することで自食を促進します。TFEBの活性はリン酸化イベントによって調節され、脱リン酸化されると、TFEBは細胞質から核に移行し、自食関連遺伝子の転写を活性化します。しかし、高浸透圧ストレスがカルシウムイオン（Ca²⁺）シグナル経路およびTRPML1チャネルを通じてTFEBの核移行をどのように調節するかについては、まだ深く探求されるべき問題です。
論文の出典「Hyperosmotic Stress Promotes the Nuclear Translocation of TFEB in Tubular Epithelial Cells Depending on Intracellular Ca²⁺ Signals via TRPML Channels」と題されたこの論文は、Takashi Miyano、Atsushi Suzuki、Hisaaki Konta、およびNaoya Sakamotoによって共同執筆されました。彼らはそれぞれ東京理科大学（Tokyo University of Science）および東京都立大学（Tokyo Metropolitan University）の機械システム工学研究科に所属しています。この論文は2025年1月21日に『Cellular and Molecular Bioengineering』誌にオンライン掲載され、DOIは10.1007/s12195-024-00839-6です。
研究の流れ研究の目的本研究は、高浸透圧ストレスがTFEBおよびCa²⁺シグナル経路を通じて自食を活性化するメカニズムを明らかにし、細胞が機械的ストレスにどのように反応するかを解明することを目的としています。具体的には、研究チームはマンニトール（mannitol）を使用して高浸透圧ストレスを誘導し、TFEBの核移行現象を観察し、TRPML1チャネルおよびカルシニューリン（calcineurin）がこの過程で果たす役割を探求しました。
実験方法細胞培養と高浸透圧刺激

研究では、NRK-52Eラット尿細管上皮細胞を実験対象として使用しました。細胞は10%胎児ウシ血清を含むDMEM培地で培養され、80%のコンフルエンスに達した時点で、マンニトールを含む高浸透圧培地で処理されました。Ca²⁺シグナル経路の役割を研究するために、研究チームは細胞内Ca²⁺キレート剤であるBAPTA-AMおよびカルシニューリン阻害剤FK-506を使用しました。さらに、TRPML1アンタゴニストであるML-SI3を使用してTRPML1チャネルの機能を評価しました。
免疫蛍光染色と核移行の評価

免疫蛍光染色を通じてTFEBの核移行現象を観察しました。細胞は4%パラホルムアルデヒドで固定され、抗TFEB抗体およびAlexa Fluor 488標識二次抗体で染色されました。細胞核はHoechst 33342で染色されました。ImageJソフトウェアを使用して、核および細胞質中の蛍光強度を定量分析し、TFEBの核移行の程度を評価しました。
RNA抽出とリアルタイム定量PCR

NRK-52E細胞から全RNAを抽出し、cDNAに逆転写しました。リアルタイム定量PCR（RT-qPCR）を使用して、TFEB標的遺伝子（LC3、VPS18、LAMP1、LAMP2など）の発現レベルを検出しました。データは2−ΔΔCt法を用いて標準化分析されました。
ウェスタンブロット分析

ウェスタンブロット分析を通じてp70S6Kのリン酸化レベルを分析し、mTORC1の活性を評価しました。さらに、自食マーカーとしてLC3-IIのタンパク質レベルを分析しました。核および細胞質部分は核/細胞質分離キットを使用して分離され、GAPDHおよびLamin A/Cを内部標準として使用しました。
主な結果マンニトール誘導性の高浸透圧ストレスがTFEB核移行を促進

実験結果は、マンニトール処理がTFEBの細胞質から核への移行を著しく促進し、この現象が1時間後にピークに達することを示しました。一方、尿素（urea）処理はTFEBの核局在を有意に変化させず、TFEBの核移行が細胞収縮による機械的ストレスと密接に関連していることを示唆しました。
Ca²⁺シグナル経路がTFEB核移行を調節

BAPTA-AMを使用して細胞内Ca²⁺をキレートすると、TFEBの核移行が完全に抑制されましたが、EGTAを使用して細胞外Ca²⁺をキレートしても有意な影響はありませんでした。これは、細胞内Ca²⁺が高浸透圧ストレス誘導性のTFEB活性化において重要な役割を果たしていることを示しています。
カルシニューリンがTFEB核移行に果たす役割

高浸透圧ストレスはカルシニューリンの活性を著しく促進し、その下流の転写因子NFATの核移行によって検証されました。FK-506を使用してカルシニューリンを阻害すると、TFEBの核移行が著しく抑制され、カルシニューリンが高浸透圧ストレス誘導性のTFEB活性化において重要な役割を果たしていることが示されました。
TRPML1チャネルがTFEB核移行に果たす役割

TRPML1アンタゴニストであるML-SI3は、高浸透圧ストレス誘導性のTFEB核移行およびLC3-IIの上昇を著しく抑制し、TRPML1チャネルがCa²⁺の放出を通じてカルシニューリンを活性化し、TFEBの核移行および自食を促進することを示しました。
結論本研究は、マンニトール誘導性の高浸透圧ストレスがTRPML1チャネルおよびカルシニューリンを介してTFEBを活性化し、その核移行および自食関連遺伝子の発現を促進することを示しました。この発見は、高浸透圧ストレスが自食を誘導する分子メカニズムを明らかにするだけでなく、細胞が機械的ストレスを生物学的反応に変換する方法を理解するための新しい視点を提供します。
研究のハイライト高浸透圧ストレス誘導性自食の新たなメカニズムを解明

本研究は、TRPML1チャネルおよびカルシニューリンが高浸透圧ストレス誘導性のTFEB核移行において果たす重要な役割を初めて明らかにし、この分野の知識の空白を埋めました。
腎臓疾患治療の新たなターゲットを提供

TFEBおよびTRPML1経路を調節することで、自食機能障害に関連する腎臓疾患の治療に新たな戦略を提供する可能性があります。
革新的な実験デザイン

研究チームは、免疫蛍光染色、ウェスタンブロット、RT-qPCRなどの多様な技術を組み合わせることで、高浸透圧ストレス誘導性自食の分子メカニズムを体系的に明らかにし、関連分野の研究に重要な実験的参考を提供しました。
研究の意義本研究は、高浸透圧ストレス誘導性自食のメカニズムに対する理解を深めるだけでなく、腎臓疾患の新たな治療法の開発に理論的根拠を提供します。さらに、研究結果は、他の機械的ストレス関連の細胞反応を探求するための新たな研究方向性を提供します。