TPN10475はTGF-βシグナル伝達を促進することで効果T細胞の活性化を抑制し、実験的自己免疫性脳脊髄炎の症状を軽減する

序論

多発性硬化症(Multiple Sclerosis, MS)は、免疫細胞が介在する中枢神経系(central nervous system, CNS)の炎症性脱髄疾患であり、複雑な病因と不明確な発症メカニズムを有している。MSは若年者の神経機能障害を特徴とし、非外傷性の障害性疾患であり、その有病率は世界中で増加し続けている。現在のMS治療薬はある程度病状をコントロールしているが、副作用や薬剤関連の重篤な有害事象は依然として大きな医療上の課題である。

実験的自己免疫性脳脊髄炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, EAE)は、MSの動物モデルとしてよく使用され、疾患の発症メカニズムと潜在的な治療法の研究に用いられる。EAEの病理学と組織学はMSと非常に類似しており、主に中枢神経系における異常な炎症細胞浸潤として現れ、神経軸索の脱髄を引き起こす。

MSの発症過程において、CD4+ T細胞は重要な参加者であり、特にTh1細胞とTh17細胞は、炎症因子とサイトカインを産生することで脊髄と軸索を損傷し、さらに多くの炎症細胞を引き寄せて炎症反応を悪化させる。さらに、CD4+ T細胞は特定のCD4+ T制御細胞(Treg)や他の制御フィードバックメカニズムを通じて、効果CD4+ T細胞の機能を抑制し、炎症を下方制御することもできる。

形質転換増殖因子β(Transforming Growth Factor Beta, TGF-β)は、細胞増殖、分化、および転移を制御する重要な細胞間シグナルのクラスであり、細胞膜表面の受容体複合体を介してシグナル伝達を媒介し、最終的に標的遺伝子の発現を調節する。研究によると、TGF-βは免疫調節において重要な役割を果たし、免疫細胞の増殖、分化、および活性化の抑制を含む。

アルテミシニンとその誘導体は抗マラリア作用で知られているだけでなく、近年では強力な免疫抑制活性を示し、MSや関節リウマチなどの自己免疫疾患において顕著な治療効果を示している。アルテミシニン誘導体TPN10466は、マウスEAE疾患においてTreg細胞の増殖と機能を増強することで保護作用を発揮することができる。

本研究は、新しいアルテミシニン誘導体TPN10475に焦点を当て、EAEの症状緩和効果とそのメカニズムを探索することを目的としている。研究結果は、TPN10475がTCRシグナル刺激によって誘導されるTGF-βシグナル伝達の減少に効果的に抵抗し、効果CD4+ T細胞の活性化機能を抑制し、病理学的Th1細胞とTh17細胞の分化を制限することを示している。さらに、TPN10475は末梢の自己反応性ヘルパーT細胞の活性化駆動を減少させ、炎症細胞の中枢神経系への移動を抑制することでEAEの症状を軽減した。

材料と方法

研究に使用されたマウスは6-8週齢の雄性C57BL/6マウスで、すべてGempharmatechから購入し、同済大学の動物ケア施設で飼育された。すべての動物実験手順は同済大学動物研究倫理委員会の承認を得た。

CD4+ T細胞の分離と体外極性化

磁気細胞選別技術を用いてマウス脾細胞からCD4+ T細胞を精製し、抗マウスCD3抗体と抗マウスCD28抗体で細胞を活性化し、異なるサイトカインを含むRPMI 1640培地で細胞を極性化した。

細胞増殖と活性の検出

カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル(CFSE)染料を用いてリンパ球の細胞分裂を追跡し、Cell Counting Kit-8(CCK8)溶液を用いてHEK293T細胞の成長を評価した。

フローサイトメトリー分析

フローサイトメトリーを用いて、体外および体内実験における細胞表面マーカーとサイトカイン発現を分析し、細胞活性とアポトーシスを検出した。

定量リアルタイムPCR

CD4+ T細胞の総RNAを抽出し、cDNAに逆転写し、定量リアルタイムPCRを用いて特定遺伝子の発現を検出した。

酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)

市販のELISAキットを用いて、細胞培養上清とマウス血清中の炎症性サイトカインと抗炎症性サイトカインの濃度を測定した。

EAEの誘導と評価

MOG35-55ペプチドの皮下免疫注射によってマウスにEAEを誘導し、マウスの体重変化と臨床スコアを評価し、病理学的分析を用いて脊髄の炎症細胞浸潤と白質脱髄の状況を評価した。

RNAシーケンシング分析

CD4+ T細胞の総RNAを抽出し、RNA-seq分析を行って差異発現遺伝子をスクリーニングし、ヒートマップ、火山プロット、KEGGパスウェイ分析、遺伝子オントロジー(GO)分析を実施した。

統計分析

実験データは平均値±標準誤差で表し、非ペアのt検定またはMann-Whitney U検定を用いて統計分析を行い、統計的有意性はP < 0.05とした。

結果

TPN10475はCD4+ T細胞の増殖と効果機能を抑制する

体外実験により、TPN10475が抗CD3/CD28活性化誘導による効果記憶CD4+ T細胞の生成を有意に抑制することが証明された。さらなる分析により、効果記憶CD4+ T細胞が分泌するIFN-γとTNF-αに対しても明らかな抑制作用があることが示された。これはTPN10475が効果記憶CD4+ T細胞の機能を抑制する作用を持つことを示している。

TPN10475はTh1細胞とTh17細胞の発達を制限する

さらなる研究により、TPN10475が用量依存的にTh1細胞とTh17細胞の生成を抑制し、Treg細胞に対してはわずかに促進作用があることが分かった。TPN10475はまた、Th1細胞によるIFN-γとTNF-αの分泌、およびTh17細胞によるIL-17AとGM-CSFの分泌能力を抑制した。

TPN10475はEAEマウスの臨床症状を軽減する

EAEマウスに異なる用量のTPN10475を経口投与した結果、TPN10475がEAEマウスの臨床症状を軽減するだけでなく、疾患の発症時期も遅延させることが示された。病理学的分析により、TPN10475が脊髄の炎症細胞浸潤と白質脱髄面積を著しく減少させることが示された。

TPN10475はCNSにおける炎症反応を抑制する

フローサイトメトリー分析により、TPN10475処理群のマウスCNSにおける浸潤CD4+ T細胞の割合が著しく低下し、特にTh17細胞とTh1様Th17細胞サブセットの割合が著しく減少したことが示された。これはTPN10475がCNSにおける炎症細胞浸潤を減少させることができることを示している。

TPN10475はEAE早期の炎症惹起を抑制する

研究により、治療群マウスの疾患早期における末梢血清中の炎症性サイトカインの分泌が著しく減少したことが分かった。これはTPN10475がEAE発症の早期段階から明らかな抗炎症作用を発揮できることを示している。

TPN10475はEAE発症初期の末梢組織免疫反応を調節する

フローサイトメトリー分析により、TPN10475がEAEマウスの脾臓と末梢リンパ節におけるCD4+ T細胞の割合を著しく低下させ、同時にTh1細胞、Th17細胞、Th1様Th17細胞の割合を著しく減少させ、Treg細胞の生成を促進したことが示された。さらに、TPN10475は末梢免疫細胞が分泌する炎症性サイトカインのレベルを著しく低下させ、その免疫調節作用をさらに検証した。

TPN10475はTGF-β受容体シグナル経路を増強することで効果CD4+ T細胞の活性化を抑制する

RNAシーケンシング分析により、TPN10475がTGF-β受容体シグナル経路と炎症反応の負の調節に著しい影響を与え、TGF-β受容体シグナル経路関連遺伝子の発現レベルを上昇させたことが示された。実験結果はさらに、TPN10475がTGF-βシグナル経路を促進することで効果CD4+ T細胞の活性化を抑制し、Th1細胞とTh17細胞の分化を制限したことを確認した。

TGF-βシグナルの抑制はTPN10475の活性化CD4+ T細胞への影響を逆転させる

TGF-β受容体阻害剤LY2109761を用いてCD4+ T細胞に介入したところ、TGF-βシグナルをブロックするとTPN10475の活性化CD4+ T細胞に対する抑制作用が逆転することが分かった。これはさらに、TPN10475がTGF-βシグナル経路を促進することで効果CD4+ T細胞の活性化を抑制するメカニズムを検証した。

結論

本研究により、アルテミシニン誘導体TPN10475がTGF-βシグナル伝達を促進することで、効果CD4+ T細胞の増殖と活性化を著しく抑制し、病理学的Th1細胞とTh17細胞の分化を制限し、末梢の自己反応性ヘルパーT細胞の活性化駆動と炎症細胞の中枢神経系への移動を減少させることでEAEの症状を軽減したことが明らかになった。この研究は自己免疫疾患の治療のさらなる研究に貴重な参考を提供し、TGF-βシグナル経路の調節によるEAEの緩和に潜在的な基礎を提供した。