通过宿主DNA消除提高结肠组织活检中简化的鸟枪法宏基因组测序灵敏度

2024-08-13 Tue
高通量宏基因组测序在结肠组织活检中的高灵敏度：去除宿主DNA的影响背景在无培养条件下通过下一代测序技术评估细菌分类结构，已成为研究细菌失衡与各种疾病关系的常用方法。已有研究通过16S rRNA基因扩增子或宏基因组测序分析了人类口腔、肠道粘膜和粪便样本的微生物群落谱。然而，16S rRNA基因测序在分类识别的分辨率方面存在局限性，而宏基因组测序能够识别到种甚至亚种水平的细菌。此外，宏基因组测序还可提供多界数据，推测跨多个领域的相互作用。
虽然宏基因组测序在表征组织样本中的微生物群落方面具有重要的临床应用，包括疾病的诊断和治疗，但样本中的人类DNA占多数，限制了低丰度细菌的检测。这种DNA丰度的不平衡导致组织样本中宏基因组测序灵敏度降低。因此，为解决这一问题，研究人员提出了一种优化的方法，通过宿主DNA去除来提高结肠活检样本中宏基因组测序的有效性。
论文来源本文的研究由来自香港中文大学消化疾病国家重点实验室的研究团队开展，主要作者包括Wing Yin Cheng、Wei-Xin Liu、Yanqiang Ding、Guoping Wang、Yu Shi等。这篇文章发表在《Genomics, Proteomics & Bioinformatics》21卷（2023年）上。
研究流程在本研究中，研究人员对人类或小鼠的结肠活检样本进行分组实验，一组进行宿主DNA去除，另一组作为对照。宿主DNA通过哺乳动物细胞与细菌细胞的差异溶解进行去除，然后进行样本的宏基因组测序。研究流程共由以下几个步骤构成：
样本均质化与分组：将人类和小鼠结肠组织均质化后等量分为两部分，一部分进行宿主DNA去除，另一部分作为对照组。
宿主细胞差异溶解：
对宿主去除组，先裂解哺乳动物细胞以释放宿主DNA，宿主DNA通过Benzonase酶降解。
随后裂解细菌细胞提取细菌DNA进行宏基因组测序。
宏基因组测序：使用Illumina HiSeq 2000平台进行配对末端150 bp（PE150）测序。测序数据与参考基因组数据库对齐，以进行分类学分析。
数据分析：
使用Trimmomatic对测序读数质量进行过滤。
通过Bowtie-2进行端对端对齐以剔除宿主序列。
其余非宿主读数使用Kraken分类分配软件对细菌基因组数据库进行对齐。
研究结果该研究表明，宿主DNA去除显著提高了细菌读数，并增加了物种发现的数量。在人类和小鼠的结肠组织样本中，去除宿主DNA后，细菌序列读数分别增加了2.46± 0.20倍和5.46 ± 0.42倍，而宿主读数则减少了6.80% ± 1.06%和10.2% ± 0.83%。此外，去除宿主DNA后细菌物种的检测数量显著增加，在人类样本中检测到2998±401个物种，而对照组仅检测到891±98个物种；在小鼠样本中检测到3707±1465个物种，而对照组为1555±314个物种。大部分非去除组的细菌物种（人类为93.45%±0.89%，小鼠为83.34%±7.00%）在去除组中也被检测到，表明该方法在提高物种检测灵敏度的同时未削弱微生物组成。总体上，宿主DNA去除显著增加了组织样本中的细菌检测覆盖率，并增加了多样性。
此外，宿主DNA去除还增加了细菌基因的覆盖率。基因累积分析表明，人类结肠活检样本中细菌基因检测增加了33.89%，小鼠样本中增加了95.75%。
结论与价值研究结果表明，通过优化的宿主DNA去除方法，能够在提高宏基因组测序灵敏度和细菌检测覆盖率的同时，保持微生物群落的相对多样性。该方法在组织活检样本上表现出色，具有重要的临床应用价值。例如，它能够识别对疾病发生或进展重要的细菌，从而为疾病的早期诊断和治疗提供依据。在微量组织样本有限的情况下，该方法可以保留更多样本用于其他分析，如转录组学、蛋白质组学和代谢组学。此外，该方法易于应用于临床样本的处理，特别是在研究肠道微生物群落与宿主健康关系方面具有广泛的应用前景。
研究亮点宿主DNA去除技术大幅提高了宏基因组测序的灵敏度和物种检测范围。
保持了微生物群落的相对组成，未显著改变结构。
提取到的细菌基因在数量和多样性方面得到了显著提升。
该方法的应用范围广泛，对临床样本的处理具有重要意义。
进一步研究未来的研究可以针对不同类型的组织样本继续优化宿主DNA去除方法，并探讨其在其他临床应用中的潜力和局限性。研究人员还可调查该方法在不同疾病状态中的应用效果，以期进一步推进这一领域的研究和临床应用。