PRDX5和PRDX6在牛精子冷冻保存中的氧化应激反应

学术背景

冷冻保存是动物繁殖和辅助生殖技术中的关键步骤，尤其是在牛精子的保存中。然而，冷冻保存过程中产生的氧化应激会显著降低精子的质量，导致DNA断裂、线粒体功能受损以及膜流动性改变等问题。这些问题不仅影响精子的活力和存活率，还可能影响其受精能力。为了应对氧化应激，细胞内的抗氧化蛋白，特别是过氧化物还原酶（Peroxiredoxins, PRDXs）发挥了重要作用。PRDXs是一类抗氧化酶，能够清除活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS），保护细胞免受氧化损伤。

在这项研究中，作者重点关注了PRDX5和PRDX6这两种PRDXs在牛精子冷冻保存中的行为。PRDX5主要位于线粒体鞘中，保护线粒体功能，而PRDX6则主要位于细胞膜上，具有修复氧化磷脂的能力。冷冻保存过程中，这两种蛋白的定位和功能可能会发生变化，进而影响精子的抗氧化能力。因此，研究PRDX5和PRDX6在冷冻保存中的行为，不仅有助于理解精子在氧化应激下的保护机制，还可能为改进冷冻保存技术提供新的思路。

论文来源

这篇论文由波兰科学院动物繁殖与食品研究所的Agnieszka Mostek-Majewska、Magdalena Bossowska-Nowicka、Mariola Słowińska和Andrzej Ciereszko共同完成，并于2025年发表在《Cell Communication and Signaling》期刊上。该研究得到了波兰国家科学中心的资助（项目编号：2021/43/D/NZ9/01916）。

研究流程

1. 研究材料与冷冻保存

研究使用了8头成年荷斯坦-弗里斯兰公牛的精子样本。精液通过人工阴道采集后，立即用无蛋白的Bioxcell稀释液稀释，并在4°C下运输至实验室。冷冻保存前，精液样本在4°C下平衡2小时，随后用液氮冷冻保存。

2. 精子质量参数测量

研究通过计算机辅助荧光显微镜（NucleoCounter SP-100）测量了精子的浓度和存活率，并使用计算机辅助精子分析系统（HT CASA II）评估了精子的运动能力。此外，研究还通过流式细胞术（Guava EasyCyte系统）测量了精子的线粒体膜电位（Mitochondrial Membrane Potential, MMP）、DNA断裂、膜流动性以及细胞内一氧化氮（Nitric Oxide, NO）和活性氧（ROS）水平。

3. PRDX5和PRDX6的定位与表达

研究使用荧光标记的抗体，通过成像流式细胞术（Imaging Flow Cytometry）检测了PRDX5和PRDX6在精子表面的定位及其在冷冻保存前后的变化。此外，研究还通过Western blotting分析了PRDX5和PRDX6在精液外泌体（Extracellular Vesicles, EVs）和去外泌体精浆中的表达。

4. PRDX5和PRDX6的寡聚化

研究通过非还原性SDS-PAGE和免疫印迹技术，分析了PRDX5和PRDX6在冷冻保存前后的寡聚化状态。结果显示，冷冻保存后，PRDX5和PRDX6形成了高分子量（High-Molecular-Weight, HMW）寡聚体，这些寡聚体通过二硫键稳定。

5. PRDX5和PRDX6与TLR4的相互作用

研究通过免疫共沉淀技术，检测了PRDX5和PRDX6与Toll样受体4（Toll-Like Receptor 4, TLR4）的相互作用。结果显示，PRDX5和PRDX6与TLR4形成了复合物，这可能与它们在氧化应激下的细胞内运输有关。

主要结果

1. 冷冻保存对精子质量的影响

冷冻保存显著增加了精子的ROS和NO水平，导致线粒体膜电位下降、DNA断裂增加以及膜流动性升高。这些变化表明，冷冻保存诱导的氧化应激对精子质量产生了显著的负面影响。

2. PRDX5和PRDX6的定位变化

冷冻保存后，PRDX5从精子表面向细胞内转移，而PRDX6则从细胞内转移到细胞膜上。这种定位变化可能是精子应对氧化应激的一种保护机制。

3. PRDX5和PRDX6的寡聚化

冷冻保存后，PRDX5和PRDX6形成了高分子量寡聚体。这些寡聚体通过二硫键稳定，表明冷冻保存诱导的氧化应激促使PRDX5和PRDX6从过氧化物酶功能转向分子伴侣功能。

4. PRDX5和PRDX6与TLR4的相互作用

研究证实，PRDX5和PRDX6与TLR4形成了复合物。这种相互作用可能在氧化应激下调节PRDX5和PRDX6的细胞内运输和功能。

结论与意义

这项研究揭示了PRDX5和PRDX6在牛精子冷冻保存中的重要作用。冷冻保存诱导的氧化应激促使这两种蛋白发生定位变化和寡聚化，进而发挥分子伴侣功能，保护精子免受氧化损伤。此外，PRDX5和PRDX6与TLR4的相互作用可能进一步增强了它们的抗氧化能力。

这些发现不仅深化了我们对精子抗氧化机制的理解，还为改进冷冻保存技术提供了新的思路。通过调控PRDX5和PRDX6的表达和功能，可能有助于提高冷冻精子的质量和受精能力，从而推动动物繁殖和人类辅助生殖技术的发展。

研究亮点

1. 首次发现PRDX5和PRDX6在冷冻保存中的定位变化：研究首次报道了PRDX5和PRDX6在冷冻保存过程中从细胞内到细胞膜的重新定位，揭示了它们在氧化应激下的保护机制。
2. PRDX5和PRDX6的寡聚化：研究首次证明了PRDX5和PRDX6在冷冻保存后形成高分子量寡聚体，并通过二硫键稳定，表明它们可能从过氧化物酶功能转向分子伴侣功能。
3. PRDX5和PRDX6与TLR4的相互作用：研究首次揭示了PRDX5和PRDX6与TLR4的相互作用，这可能与它们在氧化应激下的细胞内运输和功能调节有关。

其他有价值的信息

研究还发现，PRDX5和PRDX6存在于精液外泌体中，这表明外泌体可能作为一种运输系统，将这两种抗氧化蛋白输送到精子细胞中，进一步增强精子的抗氧化能力。这一发现为未来研究外泌体在精子保护中的作用提供了新的方向。