米尔贝霉素肟药物中三种新异构体杂质的分离与鉴定

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米尔贝霉素肟药物中三种新异构体杂质的分离与鉴定

学术背景

米尔贝霉素（Milbemycins）是一类由链霉菌（Streptomyces）产生的16元大环内酯类化合物，具有强效的抗寄生虫和杀虫活性，同时对哺乳动物的毒性较低。米尔贝霉素及其衍生物在农业和兽医领域被广泛用于控制多种昆虫和寄生虫。米尔贝霉素肟（Milbemycin Oxime, MO）是一种半合成产品，通过米尔贝霉素A3和A4的氧化和肟化反应制备而成，自1990年首次上市以来，主要用于预防犬心丝虫病和控制其他内寄生虫。

然而，作为从天然化合物中半合成的产品，MO在合成过程中不可避免地会形成杂质，包括残留的起始原料、中间体、降解产物和副产物。这些杂质可能影响药物的质量和安全性。尽管欧洲药典和美国药典对MO中的已知杂质进行了规定，但仍有一些未知杂质未被鉴定。因此，研究团队旨在分离和鉴定MO药物中的未知杂质，以进一步优化药物质量控制标准。

论文来源

本论文由Xiaohan Ren、Jianwei Lu、Yefei Wu、Shaoyong Zhang、Huan Qi、Hui Zhang、Jidong Wang和Linghui Zheng共同撰写。作者分别来自湖州大学生命科学学院、浙江钱江生化有限公司、台州科技职业学院和浙江汇达生物科技有限公司。该论文于2024年11月28日在线发表在The Journal of Antibiotics期刊上，DOI为10.1038/s41429-024-00791-7。

研究流程与结果

1. 杂质的检测与分离

研究团队首先通过高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）分析了实验室制备的MO样品以及两种市售MO药物（Milpro®和Hailechong®），发现其中存在两个未知杂质峰，其分子量比MO A4高出14道尔顿。根据国际协调会议（ICH）指南，这些杂质的含量在0.10%-0.15%之间，超过了0.10%的鉴定阈值，因此需要进一步鉴定。

为了分离这些杂质，研究团队开发了一种二维（2D）制备方法。首先，使用Agilent Zorbax-C3制备柱进行第一维分离，采用等度洗脱（水/甲醇/乙腈=30/35/35，v/v/v），流速为1.5 mL/min。随后，使用Sepax Amethyst C18-H制备柱进行第二维分离，采用等度洗脱（水/甲醇=15/85，v/v），流速为1.5 mL/min。通过这种方法，研究团队成功分离出三种杂质，分别命名为杂质1、杂质2和杂质3。

2. 杂质的结构鉴定

为了确定这三种杂质的结构，研究团队采用了高分辨率质谱（HRMS）和核磁共振（NMR）技术。具体步骤如下：

  • 杂质1：通过1H NMR和13C NMR分析，发现杂质1与MO A4具有相同的骨架结构，但在C-14位点缺少一个甲基，取而代之的是一个乙基。进一步的1H-1H COSY和HMBC谱图分析证实了这一结构。最终，杂质1被鉴定为14-去甲基-14-乙基-MO A4。

  • 杂质2：通过类似的NMR分析，发现杂质2与MO A4的结构相似，但在C-24位点缺少一个甲基，取而代之的是一个乙基。因此，杂质2被鉴定为24-去甲基-24-乙基-MO A4。

  • 杂质3：NMR分析显示，杂质3与MO A4的结构相似，但在C-12位点缺少一个甲基，取而代之的是一个乙基。因此，杂质3被鉴定为12-去甲基-12-乙基-MO A4。

3. 杂质的来源分析

研究团队进一步分析了这些杂质的来源。通过对比天然米尔贝霉素同系物的结构，发现这些杂质可能是由发酵液中的天然米尔贝霉素同系物经过氧化和肟化反应生成的。这一发现为MO药物的质量控制提供了重要的理论依据。

研究结论与意义

本研究成功分离并鉴定了MO药物中的三种新异构体杂质，分别为14-去甲基-14-乙基-MO A4、24-去甲基-24-乙基-MO A4和12-去甲基-12-乙基-MO A4。这些杂质的鉴定不仅填补了MO药物质量控制中的空白，还为药物生产过程中的杂质控制提供了重要的参考。

此外，研究团队开发的二维制备方法显著提高了杂质的分离效率，为复杂样品中高纯度杂质的分离提供了新的技术手段。这一方法的应用不仅适用于MO药物的质量控制，还可推广至其他复杂药物的杂质分离与鉴定。

研究亮点

  1. 新杂质的鉴定：首次分离并鉴定了MO药物中的三种新异构体杂质，填补了药物质量控制中的空白。
  2. 二维制备方法：开发了一种高效的二维制备方法，显著提高了复杂样品中杂质的分离效率。
  3. 杂质来源分析：通过对比天然米尔贝霉素同系物的结构，揭示了这些杂质的生成机制，为药物生产过程中的杂质控制提供了理论依据。

其他有价值的信息

本研究得到了浙江省自然科学基金（LGN22B020002）、湖州市公益性研究项目（2021GZ25）和台州市科技计划项目（24NYB10）的资助。研究团队还感谢浙江汇达生物科技有限公司和浙江钱江生化有限公司的支持。

通过此研究，MO药物的质量控制标准得到了进一步完善，为药物安全性和有效性的提升提供了重要支持。未来，研究团队计划进一步优化二维制备方法，并将其应用于更多复杂药物的杂质分离与鉴定中。