鉴定靶向内质网相关降解的多囊蛋白2错义突变体

学术背景

多囊肾病（Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease, ADPKD）是一种常见的遗传性疾病，最终导致终末期肾病。ADPKD主要由PKD1和PKD2基因的突变引起，这两个基因分别编码多囊蛋白1（Polycystin 1, PC1）和多囊蛋白2（Polycystin 2, PC2）。PC2是一种非选择性阳离子通道，疾病相关的突变会破坏其正常功能，包括信号传导和液体分泌。尽管已知PC1和PC2是ADPKD的致病因素，但大多数疾病相关的PC2错义突变如何导致ADPKD的机制仍不清楚。特别是，PC2错义突变是否会损害其折叠，进而导致其通过内质网相关降解（Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation, ERAD）途径被降解，尚未得到充分研究。

本研究旨在探讨疾病相关的PC2错义突变是否会影响其折叠，并导致其通过ERAD途径被降解。为此，研究人员开发了一种新的酵母PC2表达系统，并利用该系统研究了PC2的生物合成过程。他们还研究了两种疾病相关的PC2突变体（D511V和R322Q）在酵母和HEK293细胞中的稳定性、泛素化水平以及细胞表面定位，并探讨了低温条件下这些突变体的折叠是否能够被纠正。

论文来源

本论文由Christopher J. Guerriero、Marcelo D. Carattino、Katherine G. Sharp、Luke J. Kantz、Nikolay P. Gresko、Michael J. Caplan和Jeffrey L. Brodsky共同撰写。作者来自美国匹兹堡大学生物科学系、匹兹堡大学医学与细胞生物学系以及耶鲁大学细胞与分子生理学系。论文于2024年12月23日首次发表在《American Journal of Physiology-Cell Physiology》期刊上，DOI为10.1152/ajpcell.00776.2024。

研究流程与结果

1. 酵母PC2表达系统的开发

研究人员首先开发了一种新的酵母PC2表达系统，用于研究PC2的生物合成过程。他们在酵母中表达了带有N端三重HA标签的人源PC2，并构建了低拷贝（CEN）和高拷贝（2μ）的表达载体。通过比较不同拷贝数载体对酵母生长的影响，研究人员发现高拷贝载体会导致酵母生长减慢，因此后续实验主要使用低拷贝载体。

为了验证PC2在酵母中的表达和定位，研究人员对PC2进行了糖基化分析。结果显示，PC2在酵母和HEK293细胞中均被糖基化，并且通过内切糖苷酶H（Endo H）处理，PC2的糖基化形式被去除，表明PC2正确地定位到内质网（ER）并插入ER膜。进一步的活细胞显微镜观察也证实了PC2-GFP融合蛋白在酵母和HEK293细胞中主要定位于ER。

2. PC2突变体的稳定性和ERAD靶向

研究人员首先比较了野生型PC2和两种疾病相关突变体（D511V和R322Q）在酵母中的稳态表达水平。结果显示，D511V突变体的表达水平显著降低，而R322Q突变体的表达水平与野生型PC2相似。进一步的环己酰亚胺（Cycloheximide）追踪实验表明，D511V突变体在酵母中不稳定，而R322Q突变体的稳定性与野生型PC2相似。

为了探讨D511V突变体是否通过ERAD途径被降解，研究人员使用了蛋白酶体抑制剂MG132进行处理。结果显示，MG132处理显著稳定了D511V突变体，表明其确实通过ERAD途径被降解。进一步的泛素化实验表明，D511V突变体在酵母中的泛素化水平显著高于野生型PC2和R322Q突变体。

3. 酵母中的PC2功能活性检测

为了检测PC2是否在酵母中形成功能性通道，研究人员使用了一种基于酵母生长的定量检测方法。他们使用了一种缺乏内源性钾转运蛋白（Trk1和Trk2）的酵母菌株，并在低钾培养基中检测PC2的功能。结果显示，野生型PC2无法支持酵母在低钾培养基中的生长，而PC2的功能增强突变体（PC2_2a）能够支持酵母生长。然而，D511V和R322Q突变体在PC2_2a背景下均无法支持酵母生长，表明这些突变体丧失了通道功能。

4. HEK293细胞中的PC2突变体研究

为了验证酵母中的结果是否适用于高等真核细胞，研究人员在HEK293细胞中表达了PC2-GFP及其突变体。结果显示，D511V和R322Q突变体在HEK293细胞中的稳态表达水平均显著降低。进一步的环己酰亚胺追踪实验表明，这两种突变体在HEK293细胞中均不稳定，且其泛素化水平显著高于野生型PC2。

研究人员还通过细胞表面生物素化实验检测了PC2突变体在HEK293细胞表面的定位。结果显示，D511V和R322Q突变体在细胞表面的定位显著减少，表明这些突变体的折叠缺陷影响了其向细胞表面的运输。然而，在低温（26°C）条件下，这两种突变体的总表达水平和细胞表面定位均得到部分恢复，提示其折叠缺陷可以通过低温纠正。

5. 非洲爪蟾卵母细胞中的PC2功能检测

为了进一步研究PC2突变体的功能，研究人员在非洲爪蟾卵母细胞中表达了PC2的功能增强突变体（F604P）及其疾病相关突变体（D511V和R322Q），并通过双电极电压钳（Two-Electrode Voltage Clamp, TEVC）实验检测其电流。结果显示，D511V突变体在卵母细胞中完全丧失了通道功能，而R322Q突变体的电流显著低于F604P突变体，但仍高于未注射的对照组。这一结果表明，R322Q突变体的折叠缺陷在低温条件下可能被部分纠正，从而恢复部分通道功能。

结论与意义

本研究表明，某些PC2错义突变会导致蛋白质折叠缺陷，并通过ERAD途径被降解。研究人员开发了一种新的酵母PC2表达系统，用于研究PC2的生物合成和功能，并发现D511V突变体在酵母和HEK293细胞中均通过ERAD途径被降解。此外，R322Q突变体在HEK293细胞中也表现出ERAD靶向的特征，但在酵母中相对稳定。低温条件下，这两种突变体的折叠和细胞表面定位均得到部分恢复，提示其折叠缺陷可以通过药物干预进行纠正。

本研究的亮点在于开发了一种新的酵母模型系统，用于快速筛选和鉴定PC2的功能丧失突变体，并揭示了某些PC2错义突变通过ERAD途径被降解的机制。此外，研究还表明，低温可以部分纠正PC2突变体的折叠缺陷，这为开发针对ADPKD的治疗策略提供了新的思路。

研究价值

本研究不仅揭示了PC2错义突变通过ERAD途径被降解的机制，还为ADPKD的治疗提供了潜在的新策略。通过开发酵母模型系统，研究人员可以快速筛选和鉴定PC2的功能丧失突变体，并为未来的药物开发提供重要的实验平台。此外，研究还表明，低温可以部分纠正PC2突变体的折叠缺陷，这为开发针对ADPKD的蛋白质折叠纠正剂提供了理论基础。

本研究为理解PC2错义突变的致病机制提供了新的见解，并为开发针对ADPKD的治疗策略开辟了新的方向。