用改良核苷酸完全替代自扩增RNA，抑制干扰素反应并提高效力

2024-07-10 Wed
引言在新冠疫情的推动下，mRNA疫苗技术取得了显著进展，但其短半衰期和高剂量需求导致了副作用和可及性问题。为了克服这些挑战，自我扩增RNA（self-amplifying RNA, saRNA）成为了研究热点。saRNA利用来自甲病毒的RNA依赖RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRP）进行自我复制，理论上可以通过减少剂量和注射频率来提高疫苗的效力和安全性。然而，saRNA的早期研究表明，其诱导的强烈干扰素（Interferon, IFN）响应会抑制抗原表达，降低疫苗效力。本研究旨在通过完全替代改性核苷酸，抑制干扰素响应，提高saRNA的长效蛋白表达和疫苗保护效力。
研究背景本文的研究团队来自波士顿大学，包括生物医学工程系、生物设计中心、病毒学、免疫学和微生物学系、国家新兴传染病实验室、化学系等。主要作者Joshua E. McGee、Jack R. Kirsch和其他共同作者在《Nature Biotechnology》期刊上发表了这项研究，揭示了改性核苷酸在saRNA中的应用及其带来的显著效益。
研究流程研究主要分为以下几个步骤：
构建和合成saRNA库：通过体外转录（in vitro transcription, IVT）合成了一系列完全替代改性核苷酸的saRNA构建体，这些构建体编码荧光蛋白mCherry，用于评估其功能性。
体外转染和筛选：利用脂质体转染法将这些saRNA构建体转染到HEK293T细胞中，通过流式细胞术和荧光显微镜检测mCherry的表达水平。结果表明，完全替代5-羟甲基胞苷（5-hydroxymethylcytidine, hm5C）、5-甲基胞苷（5-methylcytidine, m5C）或5-甲基尿苷（5-methyluridine, m5U）的构建体表现出显著提高的转染效率。
蛋白表达评估：在HEK293T、C2C12和Jurkat细胞中进行转染实验，结果显示m5C saRNA在这三种细胞系中均表现出显著高于野生型saRNA和n1-甲基伪尿苷（n1-methylpseudouridine, n1mψ）mRNA的蛋白表达水平。
干扰素响应分析：在人外周血单个核细胞（PBMCs）中进行的实验表明，m5C saRNA显著降低了干扰素α（IFNα）和干扰素β（IFNβ）的表达，证明其在抑制早期干扰素响应方面的有效性。
体内实验：在小鼠模型中评估了m5C saRNA的蛋白表达水平和疫苗效力，结果显示m5C saRNA在低剂量下能够提供显著的保护效果，且与n1mψ mRNA和野生型saRNA相比，诱导了更持久的抗体反应。
研究结果体外转染和筛选研究表明，完全替代改性核苷酸的saRNA在HEK293T细胞中的转染效率显著高于野生型saRNA和n1mψ mRNA。特别是m5C saRNA的转染效率提高了14倍，而hm5C和m5U分别提高了10倍和8倍。这些结果通过流式细胞术和荧光显微镜的分析得到了进一步验证。
蛋白表达评估在HEK293T和C2C12细胞中，m5C saRNA的蛋白表达水平分别是野生型saRNA的68倍和314倍。Jurkat细胞中的实验表明，m5C saRNA在低剂量下也能显著提高蛋白表达水平。这些结果表明，m5C saRNA在体外模型中表现出优异的蛋白表达能力。
干扰素响应分析在人PBMCs中的实验显示，m5C saRNA能够显著抑制IFNα和IFNβ的表达。具体而言，m5C saRNA将IFNα1和IFNβ1的表达分别降低了8.5倍和3倍。这表明m5C saRNA在抑制早期干扰素响应方面具有显著优势，有助于提高疫苗的效力和安全性。
体内实验在小鼠模型中，m5C saRNA表现出长效的蛋白表达和显著的疫苗保护效果。注射m5C saRNA的小鼠在接受致死剂量的SARS-CoV-2病毒挑战后，显示出高存活率和显著的抗体反应。特别是在低剂量组中，m5C saRNA诱导的抗体滴度明显高于野生型saRNA和n1mψ mRNA，进一步证明了其在低剂量下的有效性。
结论本研究表明，完全替代改性核苷酸的saRNA能够显著抑制干扰素响应，增强蛋白表达，并在低剂量下提供有效的疫苗保护。这一发现不仅有助于改善saRNA疫苗的效力和安全性，还为saRNA在基因治疗和其他应用中的潜力提供了新的视角。
研究亮点创新性方法：研究首次证明完全替代改性核苷酸可以显著提高saRNA的转染效率和蛋白表达水平。
显著的蛋白表达：m5C saRNA在多种细胞系中表现出优异的蛋白表达能力，尤其是在低剂量下的表达效果显著。
抑制干扰素响应：m5C saRNA能够有效抑制早期干扰素响应，减少炎症反应，提高疫苗的安全性和效力。
长效疫苗保护：体内实验表明，m5C saRNA能够在低剂量下提供长效的疫苗保护，并诱导强大的抗体反应。
研究价值这项研究为saRNA技术的发展提供了重要的科学依据，特别是在疫苗和基因治疗领域。通过抑制干扰素响应和增强蛋白表达，改性核苷酸的应用有望提高saRNA疫苗的效力和安全性，减少剂量需求和副作用，从而推动saRNA技术在实际应用中的广泛普及和发展。
未来展望未来的研究将进一步评估m5C saRNA在临床级别的安全性和效力，特别是在非人灵长类动物和人类中的应用。此外，还将探索改性核苷酸在其他RNA格式中的兼容性和相互作用，以进一步解锁saRNA技术的潜力。通过持续的研究和创新，saRNA有望在疫苗和基因治疗领域带来革命性的进步。